VIRAL PLAQUE ASSAY

Materialer:

30 ml eksponentiel kultur af SF9-celler ved 5×105 celler/ml

6 brøndeplader (2 stk.)

1 flaske 4% agarosegel

1 flaske SF-900 (1.3X) medium

1steril flaske

0,5ml baculovirus supernatant

100ml SFM

1. Under sterile forhold fordeles 2 ml cellesuspension pr. brønd.

2. Lad cellerne sætte sig i bunden af pladen og inkuberes tildækket ved RT i 1 time.

3. Flasken med agarosegel anbringes i et vandbad på 70oC. Den tomme flaske og SF-900 (1,3X) anbringes i 40oC-badet.

4. Efter 1 times inkubation af pladerne ved RT observeres monolagene under inverteret mikroskop for at bekræfte, at cellerne er fastgjort og har en konfluens på 50 %.

5. Fremstil otte-log seriel fortynding af den høstede virale supernatant ved sekventielt at fortynde 0,5 ml af den foregående fortynding i 4,5 ml SFM-medium i 12-mld. Man bør slutte med 8 rør, der hver indeholder en 10-1til 10-8 fortynding af den oprindelige virusbestand.

7. Fjern sekventielt supernatanten fra hver brønd, kassér den og erstat den straks med 1 ml af den respektive virusfortynding til hver duplikatbrønd. Inkubér i 1 time vedRT.

8. Flyt flaskerne fra vandbadet til den sterile hætte, når agarosen er flydende (20-30 min.). 30 ml SF-900 (1,3X)-medium og 10 ml 4 % agarosegel overføres hurtigt til den tomme flaske, og der blandes forsigtigt. Sæt flasken med plaquing-overlays tilbage i vandbadet på 40oC indtil brug.

9. Efter denne anden inkubation på 1 time returneres flasken med fortyndet agarose og de 6 brøndeplader til emhætten.

10.Efterfølgende (fra høj til lav fortynding) fjernes virus fra brøndene og erstattes med 2 ml af den fortyndede agarose. Arbejd hurtigt for at undgå udtørring af monolaget.En Pasteurpipette tilsluttet en vakuumpumpe fjerner let spor af inokulum.

11.Ladgel hærde i 10 til 20 minutter, før det flyttes.

12.Inkubér ved 27oC i en fugtig inkubator i 4 til 10 dage.

13.Rekombinantvirus producerer mælkeagtige/grå plakater med svag kontrast, der er synlige uden farvning eller andre påvisningsmetoder.

14.Overvåg pladerne dagligt, indtil antallet af plakater, der tælles, ikke ændrer sig i to på hinanden følgende dage.

15.For at bestemme titerne af det anvendte inokulum er det optimale interval for tælling 3-20 plakater pr. brønd i en 6-brøndeplade. Titer (pfu/ml) kan beregnes ved følgende formel:

16. Overlejring af agarose med naturligt rødt farvestof:

Overlay 0,5 % agaroseløsning i SFM

tilsæt Natural Red-opløsning til en slutkoncentration på 50 mg/ml (fortyndet 3,33 mg/ml stamme 1:66,6).

Overlay 1 ml af farveløsningen til hver brønd (på en 6 brønde plade).

Overlay 1 ml af farveløsningen til hver brønd (på en 6 brønde plade).