Ubiquitin-proteasomvejen: kompleksiteten og de utallige funktioner af proteindød

Vores opfattelse af intracellulær proteinnedbrydning har ændret sig dramatisk i løbet af det seneste årti. Fra at have været en scavenger, ureguleret og uspecifik “slutpunkt”-proces er det blevet klart, at proteolyse af cellulære proteiner er en yderst kompleks, tidsmæssigt kontrolleret og stramt reguleret proces, der spiller vigtige roller i en række grundlæggende veje under cellens liv og død. Der er blevet beskrevet to store proteolytiske kaskader. Caspaser er involveret i programmeret celledød (apoptose), mens nedbrydningen af de fleste kortlivede regulerende cellulære proteiner formidles af ubiquitin-proteasomvejen. Blandt disse er regulatorer af cellecyklus og celledeling såsom mitotiske og G1-cykliner og cyklinafhængige kinaseinhibitorer, vækstregulatorer såsom c-Fos og c-Jun, tumorundertrykkere såsom p53, overfladereceptorer såsom væksthormonreceptoren og ionkanaler, f.eks. cystisk fibrose transmembran-konduktansregulator (CFTR). Systemet er også involveret i selektiv proteolyse af unormale/muterede proteiner og i behandlingen af MHC-klasse I-restriktionerede antigener (major histocompatibility complex (MHC)). Opdagelsen af, at systemet er involveret i nedbrydningen af c-myc og i den proteolytiske aktivering af NF-κB i to trin, var f.eks. et signal om ubiquitin-medieret nedbrydnings “indtræden” på området for transkriptionel regulering. Via nedbrydningen af kortlivede og centrale regulerende proteiner synes systemet at spille vigtige roller i en række grundlæggende cellulære processer. Blandt disse er regulering af cellecyklus og celledeling, inddragelse i den cellulære reaktion på stress og ekstracellulære modulatorer, morfogenese af neuronale netværk, modulering af receptorer på celleoverfladen, ionkanaler og sekretoriske veje, DNA-reparation, biogenese af organeller og regulering af immun- og inflammatoriske reaktioner. Nylige beviser tyder på, at systemet også er involveret i apoptose. Med en så bred vifte af substrater og processer er det ikke overraskende, at afvigelser i processen for nylig er blevet inddraget i patogenesen for adskillige sygdomme, både arvelige og erhvervede. Blandt disse er muskeldegeneration, der følger efter denervation eller langvarig immobilisering, visse former for Alzheimers sygdom, mandlig sterilitet og Angelmans syndrom (for nylige oversigter over ubiquitinsystemet, se refs. 1-4).

Degradation af et protein via ubiquitinvejen foregår i to diskrete og på hinanden følgende trin: (i) kovalent binding af flere ubiquitinmolekyler til proteinsubstratet og (ii) nedbrydning af det målrettede protein af 26S-proteasomkomplekset med frigivelse af frit og genanvendeligt ubiquitin. For at sikre en effektiv og specifik fjernelse af et bestemt protein på et bestemt tidspunkt skal både ubiquitinkonjugering og nedbrydning af de mærkede substrater være nøje reguleret. I en undersøgelse, der er offentliggjort i dette nummer af Proceedings (5), rapporterer Zhang og kolleger om identifikation af et aktiveringsområde i α-underenheden af proteasomaktivatoren PA28 (REG). For at indarbejde dette fund i den rette biokemiske og fysiologiske kontekst vil vi kort gennemgå vores nuværende forståelse af den ubiquitinproteolytiske vej. Systemet (afbildet i fig. 1) består af flere komponenter, der virker i samspil. En af disse, ubiquitin, et evolutionært bevaret protein på 76 rester, aktiveres i sin C-terminale Gly til et højenergi-thiolesterintermediat, en reaktion, der katalyseres af det ubiquitin-aktiverende enzym, E1. Efter aktiveringen overfører et af flere E2-enzymer (ubiquitin-carrierproteiner eller ubiquitin-konjugerende enzymer, UBC’er) den aktiverede ubiquitin-delen fra E1 til et medlem af ubiquitin-proteinligasefamilien, E3, som substratproteinet er specifikt bundet til. E3 katalyserer det sidste trin i konjugeringsprocessen, nemlig kovalent fastgørelse af ubiquitin til substratet. Den første ubiquitin-gruppe overføres til ɛ-NH2-gruppen på en Lys-rest i proteinsubstratet for at generere en isopeptidbinding. I successive reaktioner syntetiseres en polyubiquitinkæde ved processiv overførsel af yderligere aktiverede dele til Lys48 af det tidligere konjugerede ubiquitinmolekyle. Kæden tjener højst sandsynligt som en genkendelsesmarkør for proteasomet (se nedenfor). Ubiquitin K48R eller methyleret ubiquitin (hvor alle de frie aminogrupper er kemisk modificeret) kan ikke generere polyubiquitinkæder og tjener som kædeterminatorer. Når de overudtrykkes i celler eller indføres i cellefrie systemer, hæmmer de derfor proteolysen. Bindingen af substratet til E3 er specifik og antyder, at E3’er spiller en vigtig rolle i genkendelse og udvælgelse af proteiner til konjugering og efterfølgende nedbrydning. Systemets struktur synes at være hierarkisk: en enkelt E1 synes at foretage den aktivering af ubiquitin, der er nødvendig for alle modifikationer. Flere større arter af E2-enzymer blev karakteriseret i pattedyrceller. Det ser ud til, at hver E2 kan fungere sammen med et eller flere E3-enzymer. Selv om der hidtil kun er blevet beskrevet relativt få E3-enzymer, ser det ud til, at ubiquitinligaserne tilhører en stor, stadig voksende familie af enzymer. Hvad angår ligasernes genkendelsesmåde, er det med undtagelse af nogle få tilfælde usandsynligt, at hvert E3-substrat er rettet mod et enkelt substrat. Det er snarere tænkeligt, at flere forskellige cellulære proteiner kan genkendes af en enkelt ligase via et lignende, men tydeligvis ikke identisk, strukturelt motiv. Nogle få proteiner kan blive genkendt via deres frie og “destabiliserende” N-terminale rest (“N-end rule”; ref. 6). Langt de fleste cellulære proteiner er imidlertid acetylerede ved deres N-terminaler eller har “stabiliserende” aminoterminaler og er målrettet via forskellige signaler. Nogle genkendes via primære sekvenser, der befinder sig nedstrøms fra den N-terminale rest. Andre er målrettet via sekundære, posttranslationelle modifikationer som f.eks. fosforylering eller efter associering med hjælpeproteiner som f.eks. onkoproteiner eller molekylære chaperoner.

Efter konjugering nedbrydes proteindelen af adduktet af proteasomkomplekset, og frit og genanvendeligt ubiquitin frigives (for nyere oversigter om proteasomer, se refs. 7-10). Selv om den nuværende konsensus er, at 26S-proteasomet tjener som den vigtigste proteolytiske arm i ubiquitinsystemet, kan enzymets substratspektrum være bredere og også omfatte ikke-ubiquitinylerede proteiner. Et velundersøgt tilfælde er ornithindecarboxylase (ODC). ODC nedbrydes efter en ikke-kovalent associering med et antizym, der kan fungere i genkendelsesprocessen som en substratspecifik ubiquitinlignende chaperon. Andre substrater, hovedsagelig proteiner fra det endoplasmatiske retikulum (ER), kan også nedbrydes af proteasomet uden forudgående ubiquitinylering, selv om dette ikke er blevet fastslået med sikkerhed. Disse kan f.eks. omfatte misfoldede MHC-tunge kædemolekyler (HCs), pattedyrs 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA (HMG-R) og Z-varianten af α-1-antitrypsin (α1-ATZ) (gennemgået i ref. 11). Det er nu også klart, at ikke alle ubiquitinylerede proteiner er målrettet til nedbrydning af proteasomet. Dette gælder mest for celleoverfladens modne membranproteiner som f.eks. væksthormonreceptoren. For disse proteiner sker ubiquitinmodificering efter ligandbinding og er nødvendig for deres endocytose og målretning til lysosomet (gennemgået i ref. 12). Nedbrydning af membranforankrede proteiner ved hjælp af ubiquitinsystemet rejser vigtige, endnu uløste mekanistiske problemer, som for det meste er relateret til spørgsmålet om, hvordan to topologisk adskilte begivenheder som f.eks. misfoldning i ER og nedbrydning i cytosolen eller ligandbinding i det ekstracellulære domæne og ubiquitinylering på en cytosolisk hale af en receptor mødes. For celleoverflademembranproteiner er det indlysende problem, hvilken rolle ubiquitinmodifikationen spiller: Er den nødvendig for endocytose af det mærkede protein eller i et senere stadium for dets specifikke målretning og optagelse i lysosomet? For ER-proteiner, der nedbrydes af det cytosoliske proteasom, er der vigtige spørgsmål om de mekanismer, der ligger til grund for, at disse proteiner kan komme tilbage gennem membranen og tilbage i cytosolen. Transmembrandomænet af membranforankrede proteiner er hydrofobt, og dets fjernelse fra membranen involverer sandsynligvis en specialiseret, energiafhængig, kanalbaseret transport. For lumenale ER-proteiner er spørgsmålet centreret om, hvordan de transporteres tilbage til cytosolen.

Den seneste dokumentation tyder på, at princippet om ubiquitinmodifikation ikke er begrænset til målretning af proteiner til nedbrydning. Det ser ud til, at ubiquitin er medlem af en større familie, og flere ubiquitinlignende proteiner er også blevet beskrevet. Et interessant tilfælde vedrører målretning i komplekse strukturer. Det blev fundet, at lokalisering af RanGAP1, et Ran GTPase-aktiverende protein, til kerneporekompleksproteinet RanBP2, er afhængig af en enkelt og stabil kovalent modifikation af et 11,5 kDa, 101-residue ubiquitinlignende protein, SUMO-1 (13). Aktiveringsreaktionen svarer til ubiquitins og involverer E1 og en specifik E2, UBC9. Posttranslationel kovalent modifikation ved hjælp af ubiquitin og ubiquitinlignende molekyler tjener således et bredt spektrum af funktioner. Den er involveret i målretning af proteiner til nedbrydning i proteasomet og lysosomet, men har også ikke-proteolytiske funktioner.

Det bedst undersøgte proteasomkompleks, der er involveret i nedbrydning af ubiquitinmærkede proteiner, er 26S-proteasomkomplekset. Det er en “dumbshell-formet” symmetrisk struktur, der består af en central katalytisk enhed, et tøndeformet 20S-proteasomkompleks, som er flankeret på begge sider af regulerende 19S-proteasomkomplekser (19S-20S-19S). Krystalstrukturen af det eukaryote (gær) 20S-proteasom er blevet opløst ved 2,4 Å (14). Undersøgelsen har bekræftet tidligere forudsigelser om kompleksets struktur, men har også afsløret nogle uventede træk. Gærkomplekset er arrangeret som en stak af fire ringe, der hver indeholder syv forskellige underenheder, α1-7β1-7β1-7β1-7α1-7. De forskellige α- og β-underenheder har molekylære masser i intervallet 25-30 kDa. De aktive steder befinder sig i tre β-underenheder, β1, β2 og β5, men ikke i α-underenhederne. Topologisk analyse af placeringen af de forskellige underenheder har afsløret, at for de tre forskellige proteolytiske aktiviteter, de trypsinlignende, chymotrypsinlignende og postglutamylpeptidylhydrolytiske aktiviteter, genereres de aktive steder af tilstødende par af identiske β-type underenheder, der befinder sig i forskellige β-ringe. En analyse af de aktive stedrester afslører en ny form for proteolytisk mekanisme. De tre β-underenheder gennemgår autokatalyse mellem den sidste Gly-rest i pro-peptidet og Thr1 i den modne underenhed, der deltager i den autokatalytiske proces og bliver en væsentlig del af det katalytiske sted. Opløsningen af krystalstrukturen muliggjorde også en bedre forståelse af virkemåden for de forskellige proteasomhæmmere. Thr1 i β1, β2 og β5 binder den mindre specifikke calpain I-inhibitor Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). Lactacystin, en mere specifik inhibitor, kan bindes kovalent til β5, hvor den desuden kan generere et væld af hydrogenbindinger med andre omgivende sidekæder. Mutationsanalyser har afsløret, at de andre β-underenheder, især β4 og β7, der ligger ved siden af β5 og β1, påvirker disse underenheders aktivitet. β6 og β7 dannes også fra pro-proteiner via specifik processering. β3 og β4 behandles ikke. På grund af deres mulige rolle i etableringen af intersubunitkontakter og stabilisering af kompleksstrukturen ser det ud til, at propeptiderne er essentielle for biogenese og stabilisering af den proteasomale struktur, og at processering først sker efter samling. Krystalstrukturen har også vist, at α-kæderne, selv om de er katalytisk inaktive, spiller en væsentlig rolle i stabiliseringen af β-kædenes to-ringstruktur. De må også spille en rolle i bindingen af 19S cap-komplekserne, men strukturen af kontakterne og bindingsmekanismerne vil først blive belyst, når krystalstrukturen af 26S-komplekset vil blive opløst. Krystalstrukturen har også afsløret en afstand på 28 Å mellem Thr1-rester af tilstødende aktive β-underenheder. Denne afstand bestemmer sandsynligvis længden af de peptider, der genereres under den proteolytiske proces (≈8-aa-rester), og forklarer proteasomets rolle i genereringen af antigeniske peptider, der præsenteres på MHC-molekyler af klasse I. Eksistensen af mellemprodukter af variabel længde tyder imidlertid på, at der findes et andet hydrolytisk sted nedstrøms Thr1 (se nedenfor).

Et vigtigt, men endnu uløst, problem vedrører indgangen af proteinsubstrater og udgangen af proteolytiske produkter fra proteasomet. Det arkebakterielle (Thermoplasma acidophilum) proteasom indeholder to indgangsporer på ≈13 Å i de to ender af cylinderen, der er omgivet af definerede segmenter af de syv α-kæder. I slående og temmelig overraskende kontrast findes disse indgangsporte ikke i det eukaryote 20S-proteasom, og indgang til det katalytiske kammer mellem β-ringerne er ikke mulig fra enderne af komplekset. De N-terminale domæner af α1, α2, α3, α6 og α7 rager ud mod hinanden og udfylder rummet i flere lag af tæt interagerende sidekæder. Indgang fra enderne vil således kun være mulig efter en betydelig omlægning, der potentielt kan forekomme efter tilknytning til 19S-komplekset. En sådan omlægning kan også kræve metabolisk energi, som kan tilvejebringes af ATPaseaktiviteten hos flere af 19S-kompleksets underenheder. Gærkomplekset udviser nogle smalle sideåbninger, især ved grænsefladen mellem α- og β-ringene. Disse åbninger fører direkte til de aktive Thr1-steder. De er belagt med polære rester, der potentielt kan omarrangere sig til at generere ≈10 Å-åbninger, hvorigennem udfoldede og forlængede proteinsubstrater kan trænge ind.

Regulering af 20S proteasomets aktivitet sker på flere niveauer. Efter stimulering af antigenpræsenterende celler med interferon γ erstattes tre konstitutive β-underenheder, 1, 2 og 5, med nye og særskilte β-underenheder, β1i (LMP2), β2i (MECL1) og β5i (LMP7). De nye underenheder er relativt mere effektive til at generere antigenpeptider, der genkendes af MHC-klasse I-molekylerne og de relevante cytotoksiske T-celler via T-cellereceptorerne. En anden type regulering involverer kompleksdannelse med regulatoriske komplekser. 26S-proteasomet dannes efter ATP-afhængig associering af 20S-komplekset med to 19S-komplekser. 19S-komplekserne er sammensat af mindst 18 forskellige proteiner med en molekylmasse på 25-110 kDa. Dette kompleks tjener som indgangsport til den katalytiske kerne og leverer de forskellige reguleringsfunktioner, der er nødvendige for at sikre selektiv nedbrydning af ubiquitinmærkede substrater. Disse omfatter f.eks. et bindingssted for ubiquitinkæder, ubiquitinrecyclingaktivitet og flere ATPaser samt evnen til at stimulere de forskellige peptidaseaktiviteter i 20S-komplekset. Der er faktisk blevet identificeret underenheder, der udfører sådanne aktiviteter. Af særlig interesse er den ubiquitinkædebindende underenhed, som er blevet beskrevet hos både pattedyr (S5a) og planter (MBP1). Disse underenheder binder ubiquitin-monomerer; polyubiquitinkæder, og især dem, der indeholder mere end fire enheder, binder dog med højere affinitet. For nylig er gærgenet, der koder for den homologe kæde, Mcb1, blevet klonet. Overraskende nok udviser Δmcb1-deletionsmutanter ikke nogen vækstdefekt og nedbryder normalt ubiquitinylerede proteiner, bortset fra det lineære fusionsmodelprotein ubiquitin-Pro-β-Gal. De udviser dog en svag følsomhed over for stress, f.eks. ved eksponering for aminosyreanaloger (15). En mulig forklaring på disse uventede resultater er, at ubiquitinylerede proteiner genkendes af en yderligere, endnu ikke defineret, proteasomal underenhed. En af disse kandidater er det deubiquitinylerende enzym Doa4, der fungerer til at fjerne ubiquitin-moieties fra proteolytiske substrater. En anden mulighed er, at proteasomet ikke genkender ubiquitin-elementer, men at det i lighed med molekylære chaperoner associerer sig med udefinerede misfoldede motiver i proteinsubstratet. Disse motiver opstår efter “denaturering” af proteinet ved ubiquitinmærkning. Identifikation af proteasomets genkendelsesspecificitet og den rolle, som ubiquitin spiller i denne proces, er afgørende for forståelsen af proteasens virkningsmekanismer i særdeleshed og ubiquitinsystemet i almindelighed. En anden regulerende funktion af 19S-proteasomet omfatter redigering af polyubiquitinkæder. Komplekset indeholder en 37 kDa isopeptidase, der fjerner enkelte ubiquitin-moieties fra den distale ende af korte poly-ubiquitinkæder (16). Det antages, at denne isopeptidase er involveret i redigering og redning af dårligt ubiquitinylerede eller langsomt nedbrudte proteiner fra nedbrydning. Det adskiller sig i denne henseende fra Doa4 og en ATP-afhængig isopeptidase, der er associeret med proteasomet. De to enzymer er involveret i genanvendelse af ubiquitin og vedligeholdelse af det frie ubiquitinniveau i cellen.

Et andet kompleks, der associerer sig med 20S-proteasomet og øger dets aktivitet dramatisk, er PA28 (REG eller 11S-regulator; refs. 17 og 18). I modsætning til associeringen med 19S er kompleksdannelsen med PA28 ATP-uafhængig. Efter associeringen øger PA28 Vmax og nedsætter Km for 20S-komplekset over for en lang række forskellige peptider. PA28-20S-PA28-komplekset er imidlertid inaktivt over for intakte native eller ubiquitinkonjugerede proteiner. Den rene aktivator er et kompleks af to ≈28-kDa underenheder, PA28α og PA28β, som er ≈50 % identiske. Immunoprecipitation med underenhedsspecifikke antistoffer og kemiske krydsbindingseksperimenter afslørede, at PA28 er en ringformet hexamer, der er sammensat af vekslende α- og β-underenheder med en stoikiometri på (αβ)3 (19). Interessant nok er disse underenheder også 30-40 % identiske med et nukleært protein med hidtil ukendt funktion, Ki antigenet, som reagerer med sera fra patienter med den autoimmune sygdom systemisk lupus erythematosus. Det hexameriske kompleks har en ringformet struktur (fig. 1) og dækker 20S-proteasomkomplekset på enten den ene eller begge endeplader. Kappestrukturen gennemskæres af en central kanal med en 20 Å-åbning i den yderste ende og en 30 Å-åbning ved proteasombindingsfladen (20, 21). Åbningerne og kanalen tjener højst sandsynligt som en del af translokationsmaskineriet for peptid-substrater på vej til 20S-kompleksets katalytiske kammer. PA28α kan generere hexa- eller hepta-homomultimere, der associerer sig med 20S-komplekset og aktiverer det, om end mindre effektivt end (αβ)3-heteromultimeren. I modsætning hertil associerer PA28β ikke med 20S-komplekset og har ikke nogen stimulerende aktivitet. β-underenhedernes rolle er sandsynligvis at modulere PA28-aktiviteten ved indirekte at påvirke α-underenhedernes aktivitet eller ved at ændre PA28-partiklens affinitet til 20S-proteasomet.

PA28α indeholder i sin centrale del en unik sekvens, KEKE-motivet, der er et hydrofilt domæne bestående af skiftevis positivt ladede Lys-rester og negativt ladede Glu-rester. Det blev postuleret, at dette motiv, som ikke findes i PA28β, fremmer protein-protein-interaktion mellem α-underenhederne i PA28-partiklen og α-underenhederne i 20S-proteasomet (22). Mutationsanalyse viste imidlertid, at ΔKEKEKE PA28α bevarer sin stimulerende aktivitet (23). Binding til 20S-proteasomet kræver imidlertid en intakt C-terminus af PA28α og involverer muligvis C2 α-underenheden af 20S-proteasomet (8). Det blev foreslået, at fosforylering aktiverer den stimulerende aktivitet af PA28α, men denne reguleringsmåde er ikke blevet fast etableret.

Mutationel analyse af PA28α af Zhang og kolleger (5) afslørede flere inaktiverende mutationer i en defineret løkke i bunden af molekylet. Nogle af de muterede proteiner binder tæt til 20S-komplekset, men kan ikke aktivere det (5). Således kan bindingen til proteasomet klart adskilles fra den stimulerende aktivitet af PA28. Det er interessant, at der er et stort hul i fordelingen af de inaktiverende mutationer, der spænder over aminosyreresterne 51-122. Denne mutationsfrie zone repræsenterer et område, der er unikt for hver underenhed i PA28-komplekset. Den er sandsynligvis ikke involveret i PA28’s interaktion med 20S-komplekset eller i stimuleringen af dets proteolytiske aktivitet. Det kan snarere spille en rolle i partikelens funktion i den intakte celle som f.eks. i dens intracellulære lokalisering eller associering med andre komponenter, der bestemmer dens specifikke aktivitet og interaktioner.

Et vigtigt problem vedrører de fysiologiske roller af PA28. Begge underenheder er markant induceret af interferon γ, hvilket tyder på en rolle for partiklen i proteasomets antigenbehandlingsfunktion. Overekspression af PA28α i en musefibroblastlinje, der udtrykker cytomegalovirus pp89-proteinet, resulterer i en markant forøgelse af genkendelse af pp89-specifikke cytotoksiske T-celler. På samme måde blev præsentationen af et influenzanukleoprotein også forstærket (24). Undersøgelser i et cellefrit system viste, at PA28-20S-PA28-komplekset ved hjælp af en koordineret dobbeltspaltningsmekanisme effektivt kan trimme store peptider (som har flankerende sekvenser på både N- og C-terminalerne) til de præcise antigene epitoper, der genkendes af MHC-komplekset og den relevante cytotoksiske T-celle (25). Det ser således ud til, at PA28 spiller en vigtig rolle i behandlingen af antigener med henblik på præsentation på klasse I MHC-molekyler. Da PA28-20S-PA28-proteasomet ikke kan nedbryde intakte native eller ubiquitinylerede proteiner, må det virke nedstrøms for 19S-20S-19S-proteasomet, der nedbryder ubiquitin-markerede proteiner eller store peptider. Det er også muligt, selv om det ikke er blevet påvist, at der findes et enkelt asymmetrisk 19S-20S-PA28-proteasom, som kan udføre denne proteolytiske proces i to trin, den indledende proteolyse til store peptider og den endelige trimning. De symmetriske eller formodede asymmetriske PA28-holdige proteasomer kan også være involveret i den terminale nedbrydning af peptider til frie aminosyrer, en aktivitet, som ikke kan katalyseres af 19S-20S-19S-proteasomet (fig. 1). Det ser således ud til, at opklaring af PA28-kompleksets cellulære roller må afvente yderligere eksperimenter.