Ribosome engineering afslører vigtigheden af 5S rRNA autonomi for ribosom samling

Plasmidkonstruktion

Alle plasmider blev konstrueret ved Gibson assembly50, med plasmidbaggrunde fremstillet ved omvendt PCR eller restriktionsnuklease digest og indsatse genereret ved PCR eller syntetiseret kemisk af Integrated DNA Technologies. De rRNA-kodende plasmider blev indledningsvis elektroporteret i E. coli POP2136-celler (genotyperne af alle stammer, der er anvendt i denne undersøgelse, er anført i supplerende tabel 1), og transformanterne blev genvundet på LB-plader suppleret med de rette antibiotika; pladerne blev inkuberet ved 30 °C for at forhindre ekspression af rRNA-generne, der kontrolleres af lambda PL-promotoren31. Alle andre plasmider blev transformeret og opformeret i E. coli JM109-stammen og dyrket ved 37 °C i LB-medier, der om nødvendigt blev suppleret med 100 μg/ml ampicillin (Amp), 50 μg/ml kanamycin (Kan) eller 50 μg/ml spectinomycin (Spc).

Konstruktion af ptRNA100-plasmidet

Plasmidryggen, herunder replikationsoprindelsen pA15 og Spc-resistensgenet, blev PCR-amplificeret fra ptRNA67-plasmidet51 ved hjælp af primerne NA1 og NA2 (alle primere er anført i supplerende tabel 4). tRNA-genklyngen (der koder for tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp og tRNAAsp), under kontrol af Ptac-promotoren og T1-terminatoren, blev syntetiseret som en gBlock (Integrated DNA Technology). Plasmidet pTRNA100 blev fremstillet ved Gibson-assembling. Plasmidets struktur blev verificeret ved restriktionsdigest, og tilstedeværelsen af den plasmidfødte tRNA-klynge blev bekræftet ved PCR-amplifikation ved hjælp af primere NA3 og NA4 og ved sekventering.

Konstruktion af plasmiderne pDH42, pDH39 og pCH84

Konstruktionerne, der bærer hybrid 23S-cp5S rRNA-genet, blev genereret på grundlag af plasmidet pAM55229, der bærer E. coli rrnB rRNA-operonet. 5S rRNA-genet blev slettet ved invers PCR ved hjælp af primere NA17 og NA18, der indeholder Xho1-restriktionsstedet, fordøjelse af PCR-produktet med Xho1 og DNA-ligering. Ery-resistensmutationen A2058G blev derefter indført i 23S rRNA-genet ved stedbestemt mutagenese ved hjælp af QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) med primer NA7. Det resulterende plasmid, pAM552Δ5S, blev brugt til at indføre cp5S rRNA-generne med linkere tre forskellige steder i 23S rRNA-genet.

Fremstilling af cp5S rDNA-sekvensen til integration i 23S rDNA blev udført i en enkelt PCR-reaktion, hvor primerparrene NA8/NA9 (for DH39- og DH42-konstrukter) eller NA26 og NA27 (for CH84-konstrukt) (100 nM hver), der indeholdt cp5S rDNA-indsatsen, blev anvendt, blev kombineret med primerpar (250 nM hver), der introducerede tilfældige sekvenslinkere, der varierede i størrelse fra 0 til 3 nt, ved de “venstre” og “højre” 23S-cp5S-knudepunkter, som følger: NA10-NA13 og NA14-NA17 for DH39; NA18-NA21 og NA22-NA25 for DH42; NA28-NA31 og NA32-NA35 for CH84.

Til fremstilling af DH39-, DH42- og CH84-plasmidbibliotekerne blev pAM552Δ5S-plasmidet åbnet ved invers PCR ved hjælp af primerparrene NA36/NA37, NA38/NA39 og NA40/NA41, henholdsvis. cp5S rDNA-indsatserne blev introduceret i de resulterende PCR-amplificerede plasmidbaggrunde ved Gibson-monteringsreaktioner. Reaktionsprodukterne blev transformeret til E. coli POP2136-celler ved elektroporation, og transformanterne blev genvundet på LB/Amp-agarplader, der blev dyrket ved 30 °C (betingelser, der forhindrer ekspression af det plasmidbårne rRNA). Hvert bibliotek indeholdt mindst tre gange flere kloner end den anslåede teoretiske diversitet på 7225 varianter. Kolonierne blev vasket af LB-pladerne, plasmidbibliotekerne blev ekstraheret og opbevaret.

Udskiftning af ptRNA67 med ptRNA100

Den E. coli SQ171-stammen, der mangler kromosomale rRNA-alleler og bærer pCSacB-plasmidet som kilde til rRNA-gener og ptRNA67-plasmidet som kilde til de manglende kromosomale tRNA-gener32,52, blev anvendt som startværtsstamme. For at erstatte ptRNA67-plasmidet med ptRNA100 blev SQ171-cellerne først transformeret med ptRNA-Amp (stillet til rådighed af Michael O’Connor, University of Missouri, Kansas City), som ligner ptRNA67, men giver Amp-resistens og indeholder pBR322-replikationsoprindelsen. Transformanterne blev derefter kureret fra ptRNA67-plasmidet ved at passere i LB-medium suppleret med Amp og Kan i ~100 generationer. Tabet af ptRNA67-plasmidet blev verificeret ved klonernes følsomhed over for Spc ved replikpladning. Den resulterende stamme blev derefter transformeret med ptRNA100 og udplottet på LB-agar suppleret med Spc og Kan. Transformanterne blev passeret i ~100 generationer på LB-medier suppleret med Spc og Kan. Tabet af ptRNA-Amp-plasmidet blev verificeret ved de enkelte kloners følsomhed over for Amp som afsløret ved replikplating. Tilstedeværelsen af ptRNA100 og manglen på ptRNA67 blev desuden verificeret ved PCR og restriktionsdigest af de samlede plasmider fremstillet fra den resulterende klon.

Inaktivering af recA-genet i SQ171/ptRNA100-cellerne

RecA-genet i SQ171/ptRNA100-stammen blev inaktiveret ved P1-fagtransduktion. Donorstammen BW25113 recA::cat blev først fremstillet ved den konventionelle rekombinationsprocedure52 ved hjælp af chloramphenicol (Chl)-resistenskassette fra pKD3-plasmidet52. Kassetten blev PCR-amplificeret ved hjælp af primerne NA42 og NA43. PCR-fragmentet blev transformeret til BW25113-stammen, der bærer det røde rekombinaseudtrykkende plasmid pDK46. Efter verifikation af integrationen af kat-kassetten og hærdning af pKD46 blev BW25113 recA::cat-cellerne anvendt som donorer til fagetransduktion. P1-fagene blev transduceret i henhold til standardprotokollen53 , bortset fra at inkubationen til genopretning blev forlænget fra 1 til 3 timer, inden transduktanterne blev udplottet på LB/agar-plader suppleret med Kan, Spc og 15 μg/ml Chl. Til excision af kat-kassetten blev den resulterende stamme transformeret med pZFLP-TetR-plasmidet, der koder for flippaseenzymet, og transformanterne blev udplottet på LB/agar-plade suppleret med Kan, Spc og 2,5 μg/ml tetracyclin (Tet). Elimineringen af cat-genet blev bekræftet ved PCR og ved klonernes Chl-følsomhed. Derefter blev pZFLP-TetR-plasmidet kureret af ved at passere cellerne i ~100 generationer i LB-medium suppleret med Kan, Spc, og de resulterende kloner blev testet for følsomhed over for Tet. Den resulterende stamme fik navnet SQA18 (Supplerende tabel 1).

Introduktion af 23S-cp5S-bibliotekerne i SQA18-celler

Plasmidbibliotekerne, der blev ekstraheret fra POP2136-celler, blev transformeret til SQA18-celler ved elektroporation. Efter 2 timers hviletid ved 37 °C blev transformanterne udplottet på LB/Amp agarplader, som derefter blev inkuberet natten over ved 37 °C. Kolonierne blev vasket af agarpladerne, og 0,01 A600 (~106 celler) blev anbragt i et volumen på 2 ml LB-medium suppleret med 150 μg/mL Ery og 0,25 % saccharose. Efter vækst i 16 timer blev cellerne udplottet på agarplader, der indeholdt Amp, 1 mg/ml Ery og 5 % saccharose. Pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 °C. Der fremkom levedygtige kolonier med DH42- og CH84-bibliotekerne, men ikke med DH39-biblioteket. Flere af de kolonier, der dukkede op på pladerne, blev testet ved koloni-PCR for tilstedeværelsen af 23S-cp5S rDNA ved hjælp af primerparrene NA44/NA45 for DH42-konstruktionen og primerne NA46/NA47 for CH84-konstruktionen. Fravær af wt 5S rRNA-genet blev verificeret ved koloni-PCR ved hjælp af primere NA48 og NA49.

Selektion af de foretrukne 23S-cp5S rRNA-linkere

Det samlede DH42-plasmidbibliotek isoleret fra POP2136-cellerne blev transformeret til SQA18-celler og udplateret på LB/Amp-plader som beskrevet ovenfor. Kolonierne (~50 000) blev vasket af pladen, og det samlede plasmid blev ekstraheret fra ~109 celler og anvendt som et præ-selektionsbibliotek.

Omkring 109 celler blev derefter underkastet plasmidudvekslingsproceduren. Specifikt blev de anbragt i et volumen på 20 ml LB-medium suppleret med 150 μg/mL Ery og 0,25 % saccharose. Efter vækst i 4 timer blev cellerne udplottet på agarplader, der indeholdt Amp, 1 mg/ml Ery og 5 % saccharose. Pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 °C. Kolonier (~50.000) blev vasket af pladen. Det ekstraherede samlede plasmid fra disse celler repræsenterede post-selektionsbiblioteket.

Det cp5S rDNA flankeret af 23S rDNA-sekvenser og linkers blev PCR-amplificeret fra præ- og post-selektionsbiblioteksplasmidpræparaterne ved hjælp af primerne NA50 og NA51. PCR-bibliotekerne blev underkastet næste generations sekventering.

Foldberigelsesfaktoren for hver kombination af linkere blev beregnet ved hjælp af følgende procedure. Efter trimning af adapteren blev hele sekvensen af cp5S rRNA, bortset fra de terminale 4 nukleotider i hver ende, elimineret for at reducere antallet af falske sekvensvarianter, der optrådte som følge af sekventeringsfejl inden for den 5S-kodende sekvens. De resulterende sekvensmotiver blev talt i bibliotekerne før og efter udvælgelsen, og frekvensen af fraktionen af hver linkervariant blev beregnet.

Fremstilling af total cellulært RNA

Overnatskulturer af E. coli POP2136- eller SQA18-stammerne blev dyrket ved henholdsvis 30 °C eller 37 °C i LB/Amp-medium. Kulturerne blev fortyndet 1:100 i 2 ml frisk medium og dyrket ved 37 °C til A600 ~ 0,5. Cellerne blev høstet ved centrifugering (5000 × g, 1 minut) og resuspenderet i 100 μl lysisbuffer . Efter efterfølgende tilsætning af 400 μl ekstraktionsbuffer (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) og inkubation i 5 min. ved stuetemperatur blev total RNA ekstraheret ved phenol/chloroformekstraktion. RNA blev ethanoludfældet, RNA-pellet blev vasket med 1 ml 70 % ethanol, opløst i RNasefrit vand, snapfrosset og opbevaret ved -80 °C.

Sucrose gradientanalyse af ribosomer og polysomer

E. coli-kulturer fra natten blev fortyndet i 50 ml LB/Amp-medium og dyrket til A600 ~ 0,5. Chl blev tilsat til en slutkoncentration på 125 μg/ml, og efter 5 min inkubation blev cellerne høstet ved centrifugering (5000 × g, 10 min, 4 °C). Cellepellets blev resuspenderet i iskold lysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml lysozym, 0,25 % natriumdeoxycholat og 2U RQ1 RNase-fri DNase I). Cellerne blev lyseret ved tre frysnings- og optøningscyklusser. Lysaterne blev klaret ved centrifugering (20 000 × g, 15 min, 4 °C), og 20 A260 enheder lysat blev indlæst på 12 mL af 10-40 % lineær saccharosegradient i buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoethanol. Gradienterne blev centrifugeret (3 timer, 4 °C) ved 39.000 rpm i en SW41-rotor (Beckman). Gradienterne blev fraktioneret ved hjælp af en fraktioneringsmaskine (BioComp), idet absorbansen blev registreret ved 254 nm. Fraktioner svarende til 50S-underenhederne, 70S-ribosomerne og polysomerne blev lagt sammen. RNA blev isoleret ved phenol/chloroformekstraktion og ethanoludfældning.

Isolering af 70S ribosomer og ribosomale underenheder

Til isolering af tight-couple ribosomer54 blev E. coli-kulturer over natten fortyndet til 1 L LB/Amp-medium og dyrket til A600 ~ 0,5. Cellerne blev høstet ved centrifugering (5 000 g, 15 min, 4 °C), resuspenderet i buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-mercaptoethanol, 10 U/ml RQ1 RNase-fri DNase I) og lyseret ved hjælp af fransk presse ved 10 000 psi. Lysaterne blev klaret ved centrifugering i JA25-50-rotor (Beckman) ved 13 000 rpm i 30 min. ved 4 °C, og supernatanterne blev overført til 10 ml 1,1 M saccharosepude fremstillet i en buffer indeholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 og 6 mM β-mercaptoethanol, i 35 ml Quick-Seal centrifugerør (Beckman). Ribosomer blev pelleteret ved centrifugering i 16 timer ved 36.000 rpm (4 °C) i en Ti70-rotor (Beckman). Ribosompellet blev resuspenderet i buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl og 6 mM β-mercaptoethanol), og 100 A260-enheder blev indlæst på en 10-40 % saccharosegradient fremstillet i buffer B i rørene i en SW27-rotor (Beckman). Gradienterne blev centrifugeret i 21 timer ved 20 000 rpm (4 °C) i en SW27-rotor, fraktioneret ved hjælp af gradientfraktionator (BioComp), og fraktioner, der indeholdt 70S ribosomer og 50S ribosomale underenheder, blev samlet separat. Materialet blev koncentreret ved hjælp af 2 ml Vivaspin-koncentratorer (Sartorius) med cellulosetriacetatmembran og opsamlet i ribosomopbevaringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoethanol). Alikvotes af ribosomer og ribosomale underenheder blev lynfrosset og opbevaret ved -80 °C. Ved behov blev rRNA isoleret ved phenol/chloroformekstraktion og ethanoludfældning.

Til isolering af 50S-underenhederne fra 70S-ribosomerne blev 130 pmol ribosomer, fremstillet som beskrevet ovenfor, men koncentreret ved pelletering og opbevaret i ribosomopbevaringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoethanol) blev fortyndet i buffer D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-mercaptoethanol) for at nå en slutkoncentration af MgCl2 på 1,5 mM. Ribosomale underenheder blev separeret ved centrifugering i 10-40 % saccharosegradienter fremstillet i buffer D, der indeholdt 1,5 mM MgCl2. Gradienterne blev centrifugeret i 16 timer ved 27.000 rpm (4 °C) i en SW27-rotor (Beckman), fraktioneret, koncentreret og genvundet i ribosomopbevaringsbufferen som beskrevet ovenfor. Alikvotes blev lynfrosset og opbevaret ved -80 °C.

LC-MS/MS-analyse af ribosomale proteiner

Proteinsammensætningen af wt- og mutant tight-couple 70S ribosomer og 50S ribosomale underenheder, fremstillet som beskrevet ovenfor, blev bestemt ved hjælp af kvantitativ massespektrometri55. Ribosomale præparater blev blandet i et molforhold på 1:1 med SILAC-mærkede wt-ribosomer, der indeholdt massemærket arginin (Arg6: 6HN4O2) og lysin (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Tyskland). Ribosomale proteiner blev fordøjet med trypsin (Sigma) eller Lys-C protease (Wako, USA). De resulterende peptider blev fraktioneret og analyseret via LC-MS/MS ved hjælp af LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). Proteinidentifikation og kvantificeringsanalyse blev udført ved hjælp af Maxquant v1.5.6.056 og Perseus v1.6.2.357. Maxquant-søgning blev udført ved hjælp af E. coli MG1655-proteinsekvensdatabasen fra UniProtKB (24.04.2019). Proteinoverflod blev normaliseret for store og små underenhedsproteiner separat ved at forskyde det gennemsnitlige L/M-forhold til 1.

Kemisk sondering af rRNA-struktur

rRNA-struktur blev sonderet i 70S ribosomer isoleret fra wt eller mutantceller. Ribosomerne (10 pmol) blev anbragt i 50 μl modifikationsbuffer og aktiveret ved inkubation i 5 minutter ved 42 °C. Modifikationsreaktionen blev startet ved tilsætning af 2 μl dimethylsulfat (Sigma) fortyndet 1:10 i ethanol. Prøverne blev inkuberet i 10 min. ved 37 °C. Modifikationsreaktionerne blev stoppet ved tilsætning af 50 μl frisk fremstillet stopopløsning (600 mM NaOAc, 1 M β-mercaptoethanol) og 300 μl ethanol. Prøverne blev udfældet, resuspenderet i buffer (300 mM natriumacetat, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5 % SDS), og RNA blev isoleret ved phenol/chloroformekstraktion og ethanoludfældning. Primerforlængelser blev udført ved hjælp af primerne NA56-NA57.

Analyse af mutantens rRNA-indhold

Til analyse af tilstedeværelsen af det manipulerede 23S-cp5S rRNA blev total RNA isoleret fra saccharosegradientfraktionerne som beskrevet ovenfor. Indholdet af mutant 23S-cp5S rRNA blev vurderet ved primerforlængelse ved hjælp af enten NA58- eller NA59-primere. Specifikt blev 5′-mærket primer (0,5 pmol) annealet til 1 μg total RNA i hybridiseringsbuffer (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) ved inkubation ved 90 °C i 1 min. og derefter afkøling over 15 min. til 42 °C og forlænget med 2 U AMV reverse transkriptase (Roche) i 20 min. ved 42 °C i et slutreaktionsvolumen på 8 µl. For NA58-primeren indeholdt reaktionen 0,25 mM ddATP og 0,2 mM dCTP, dGTP og dTTP. For NA59-primeren indeholdt reaktionen 0,25 mM ddCTP og 0,2 mM dATP, dGTP, dTTP. Reaktionerne blev afsluttet ved at tilsætte 120 μl stopbuffer (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70 % EtOH), afkøling ved -80 °C i 15 minutter og pelletering af nukleinsyrerne ved centrifugering ved 15 000 × g i 1 time ved 4 °C. Supernatanterne blev fjernet, pellets blev tørret og opløst i formamid som farvestof. cDNA-produkterne blev opløst i en 12 % denaturerende polyacrylamidgel og visualiseret ved phosphorimaging.

In vitro-oversættelse

In vitro-oversættelsesreaktioner blev udført i Δribosome PURExpress cellefrit oversættelsessystem (New England Biolabs). DNA-skabeloner, der indeholder T7 RNA-polymerasepromotoren, ribosombindingsstedet og den proteinkodende sekvens, blev fremstillet ved PCR. ermBL-skabelonen blev fremstillet ved hjælp af primere NA52-NA55. GFP-skabelonen blev fremstillet fra sf-gfp-genet i plasmidet pY71-sfGFP58 ved hjælp af primere NA31 og NA32. Dihydrofolatreduktase (DHFR) blev udtrykt fra plasmidskabelonen leveret med PURExpress-sættet.

Translationsreaktionen til ekspression af GFP blev sammensat i et samlet volumen på 10 μl og indeholdt 2 μl af PURExpress-sættets opløsning A, 1.2 μl faktorblanding, 1 μl aminosyreblanding (3 mM hver), 1 μl tRNA (20 μg/ml), 16 U RiboLock RNaseinhibitor (ThermoFisher), 10 ng GFP-template og 12 pmol wt- eller mutant-ribosomer. Prøverne blev anbragt i brønde i en 384-well plade med sort væg/klar flad bund til vævskultur (BD Biosciences) og dækket med låg. Reaktionerne blev inkuberet ved 37 °C i en mikropladelæser (Tecan) med GFP-fluorescens registreret hver 10. minut ved λexc = 488 nm og λem = 520 nm over en periode på 4 h.

Ekspression af DHFR blev efterfulgt af inkorporering af -L-methionin i det fuldstørrelse protein. Translation blev udført i 10 μl reaktioner sammensat som beskrevet ovenfor, men suppleret med 5 μCi -L-methionin (1175 Ci/mmol) under anvendelse af 50 ng af DNA-skabelonen og 6 pmol wt- eller mutant-ribosomer. Reaktionerne blev inkuberet ved 37 °C. Hver 12. minut blev der udtaget alikvater på 1 μl, blandet med 3 μl SDS-holdigt gelbelastningsfarvestof og opbevaret på is, indtil reaktionsforløbet var afsluttet. Proteinprodukterne blev analyseret ved SDS-gelelektroforese i 16,5 % Bis-Tris-geler (Biorad) under anvendelse af NuPAGE MES/SDS-kørebuffer (Invitrogen). Gelerne blev farvet, tørret og eksponeret for en fosforimager-screening natten over. Radioaktive bånd blev visualiseret ved fosforimaging.

Cryo-EM-analyse af 70S ribosomer og 50S-underenheder

Cryo-EM-gitter blev fremstillet som følger. 400 M kobbergitter belagt med spidskulstof og et 2 nm tyndt lag kulstof (Ted Pella Inc.) blev glødudladet med 20 mA strøm med negativ polaritet i 60S i en PELCO easiGlow glødudladningsenhed. En Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) blev præ-ekvilibreret til 4 °C og 95 % relativ luftfugtighed. En alikvot af tidligere lynfrosne ribosomer blev optøet, og når der blev konstateret opalescens, blev opløsningen renset i en mikrocentrifuge (10 minutter ved 16 000 × g ved 4 °C). Koncentrationen af den rensede supernatant blev afledt af A260 målt ved hjælp af en Nanodrop (ThermoFisher), og ribosomerne blev fortyndet til 200 nM i LPP-buffer . Tre µl af 200 nM ribosomopløsning blev påført på gitteret; efter en forsinkelse på 10S blev gitteret blottet i 4S og derefter nedsænket i flydende nitrogenkølet flydende ethan.

Data blev indsamlet på et Talos-elektronmikroskop (ThermoFisher), der opererer ved 200 KV og er udstyret med en K3 direkte elektrondetektor (Gatan Inc.), der sigter på 0,5-1,8 μm underfokus. Dataindsamlingen blev automatiseret med SerialEM59 ved hjælp af stråletiltning for at indsamle flere film (f.eks. et skud på midten, 6 med forskydning) ved hver position på scenen60. Superopløsningsfilm havde i alt 19 billeder med 1,5 e-/Å2 pr. billede for en samlet dosis på 30 e-/Å2 på prøven. I alt 5222 film blev indsamlet i løbet af 22 timer. Filmene blev justeret undervejs under dataindsamlingen ved hjælp af IMOD61 for at dekomprimere billederne, anvende forstærkningsreferencen, binære superopløsningsdataene til en fysisk pixel på 0,87 Å på prøven og korrigere for billeddrift.

De tidlige trin af 3D-kortgenerering fra CTF-bestemmelse, referencefri partikelplukning (489 732 partikler) og oprettelse af stakke blev udført i cisTEM. Partikeljustering og raffinering blev udført i Frealign 9.11 og cisTEM62,63. For at fremskynde behandlingen blev der fremstillet 2×-, 4×- og 8×-binned billedstakke ved hjælp af resample.exe, som er en del af FREALIGN-distributionen64. Den oprindelige model til partikeljustering af 70S-kort var EMD-100365, som blev downsamplet til at matche 8× binned billedstakken ved hjælp af EMAN266. Der blev kørt to runder af mode 3-søgning med en højopløsnings-cutoff på 30 Å og derefter 20 Å ved hjælp af den 8× binned stack. Dernæst blev der kørt 7 runder af mode 1-raffinering med den 4×, eventuelt ikke-binnede stak, idet der gradvist blev tilføjet opløsningsskaller (grænse på 5 Å), og opløsningen nåede op til 2,94 Å. Der blev anvendt stråleforskydningsraffinering til at forbedre den samlede opløsning til 2,87 Å.

Tyve runder af 3D maximum-likelihood-klassifikation uden maskering og til 14 Å opløsning blev anvendt til hurtigt at adskille 8x binned partikler i 12 klasser af forskellige sammensætninger, der afslører 50S-underenheder, 70S ribosomer uden tRNA eller 70S ribosomer med tRNA’er og 30S i enten en roteret eller ikke-roteret konformation (Supplerende fig. 3a). 50S-partikler (133.490), tomme 70S-partikler (120.428) eller tRNA-bundne 70S-partikler i ikke-roteret tilstand (55.677) blev oprettet ved hjælp af 1x binned stakken ved hjælp af merge_classes.exe, en del af Frealign-pakken, der kræver partikel-scoringer på 0 og minimum 50 % belægning. Substackerne blev derefter igen binned til 4x ved hjælp af resample.exe for at fremskynde yderligere klassificeringstrin.

50S partikel-substakken blev adskilt i 6 klasser med en fokusmaske med en radius på 55 Å radius omkring 5S rRNA-delen af 23S-cp5S hybrid-rRNA’et. Klasser med svag eller fraværende uL16 og/eller bL33 og klasser, der adskiller sig i 5S rRNA-position, blev adskilt. Klasserne blev rekonstrueret med de oprindelige parametre for justering og stråletiltning ved 1x binning, og en af disse klasser blev anvendt til strukturel modellering som beskrevet i det følgende afsnit.

Den 70S-partikler blev også undersøgt. Den tomme (ingen tRNA) 70S-partikelsubsplit blev opdelt i 12 klasser ved hjælp af den samme 55-Å fokusmaske. Klasserne udviste forskelle i uL16- og/eller bL33-belægning og 5S rRNA-position i lighed med de ovenfor beskrevne 50S-klasser. I modsætning til 50S-partiklerne viste 3 ud af 12 tomme 70S-klasser imidlertid en normalt foldet PTC.

Klassificering af den klassiske tRNA-bundne 70S-partikelundergruppe i 12 klasser med den samme maske afslørede en næsten stoikiometrisk belægning på 16 uL, og alle partikler havde en normalt foldet PTC og en stærk P-tRNA-tæthed. I modsætning hertil var tRNA-belægningen af A-stedet svag i nogle klasser med svagere L33-tæthed. Klassificering af 70S-partiklerne med et roteret 30S og P/E-tRNA i hybridtilstand i 12 klasser afslørede også varierende belægninger af uL16 og bL33, og syv klasser havde aberrant PTC.

Den 3,2-Å cryo-EM struktur af 70S ribosomet bundet med A og P tRNA’erne67 blev brugt som startmodel for strukturforfininger. Ribosomkomponenterne/domænerne blev indpasset i kort ved hjælp af Chimera68. Her blev 50S, L1-stilken, L11-stilken, 30S-kroppen og -hovedet og tRNA’erne tilpasset uafhængigt af hinanden. Modellering af 5S rRNA og justeringer af PTC og afkodningscentret blev foretaget ved hjælp af PyMOL69. Strukturmodellerne blev forfinet ved hjælp af real space simulated-annealing-forfining ved hjælp af RS Ref 70,71 mod tilsvarende kort. Forfiningsparametre, såsom den relative vægtning af stereokemiske begrænsninger og det eksperimentelle energiterm, blev optimeret for at frembringe den optimale strukturstereokemi, realrumskorrelationskoefficient og R-faktor, som rapporterer om modellens tilpasning til kortet72. Sekundærstrukturbegrænsninger, herunder hydrogenbindingsbegrænsninger for ribosomale proteiner og baseparringsbegrænsninger for RNA-molekyler, blev anvendt som beskrevet73. Strukturerne blev derefter forfinet ved hjælp af phenix.real_space_refine74 efterfulgt af en runde af forfining i RSRef, hvor der blev anvendt harmoniske begrænsninger for at bevare proteinets geometri70,71. Phenix blev anvendt til at forfine modellernes B-faktorer i forhold til deres respektive kort uden B-faktorfiltrering74. De resulterende strukturelle modeller har gode stereokemiske parametre, der er karakteriseret ved lav afvigelse fra ideelle bindingslængder og -vinkler, og de stemmer nøje overens med de tilsvarende kort som angivet ved høje korrelationskoefficienter og lave R-faktorer i det reelle rum (Supplerende tabel 2). Figurer blev udarbejdet i PyMOL69.

Rapporteringsresumé

Der findes yderligere oplysninger om forskningsdesign i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.