Regulering af kolesterolsyntese

00:00:08.12Mit navn er Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03og jeg er fra Institut for Molekylær Genetik
00:00:12.01på University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, Texas.
00:00:00:15.17I denne præsentation,
00:00:00:17.19vil jeg tale om feedback-regulering af HMG CoA reduktase,
00:00:00:20.27som er det hastighedsbegrænsende enzym i syntesen af kolesterol.
00:00:00:25.06Så, dette dias viser strukturen af kolesterol
00:00:27.06og nogle af egenskaberne ved dette vigtige molekyle.
00:00:31.01Colesterol er et sterol,
00:00:33.10som er kendetegnet ved denne fire-ringstruktur.
00:00:36.00Denne fire-ringstruktur giver molekylet stivhed,
00:00:39.00.02som gør det til en ideel komponent i cellemembraner.
00:00:00:43.18Da kolesterol har et stort antal
00:00:46.07 kulstof-kulstof- og kulstof-vækststof-bindinger,
00:00:00:49.0702er dette molekyle stort set uopløseligt i vand.
00:00:00:52.07Så på grund af denne grund,
00:00:00:54.13skal cellerne være i stand til at opretholde kolesterol i et snævert område,
00:00:00:58.03 således at der produceres nok kolesterol til de cellulære behov for molekylet
00:01:02.13men at man undgår den giftige overakkumulering af kolesterol.
00:01:06.16Overakkumulering af kolesterol kan være giftig på celleniveau.
00:01:12.11Nu viser dette dias nogle af kolesterols vigtige funktioner.
00:01:15.10Kolesterol er absolut nødvendigt for livet.
00:01:17.26Som jeg nævnte tidligere,
00:01:19.27en af de mest velkendte roller for kolesterol
00:01:22.26er dets rolle i cellemembraner,
00:01:25.08hvor det opretholder optimal membranfluiditet.
00:01:29.2600Nu viser det sig, at kolesterol er en vigtig forløber
00:01:32.01for meget vigtige molekyler såsom steroidhormoner,
00:01:34.25som hjælper med at skelne mellem piger og drenge;
00:01:38.00.19galdesyrer, som hjælper med fordøjelsen og ernæringen ved at opløse fedtstoffer og fedtopløselige vitaminer;
00:01:47.10og endelig er der masser af kolesterol i hjernen,
00:01:50.10og endelig er der masser af kolesterol i hjernen,
00:01:50.18hvor det findes i myelinskederne, der omgiver axoner
00:01:53.17og hjælper med synap… synaptiske overførsler.
00:01:58.18Nu får celler i vores kroppe — pattedyr — pattedyrceller —
00:02:02.01kolesterol gennem to kilder.
00:02:04.En af kilderne er illustreret på dette dias,
00:02:07.06og det er gennem syntesen af kolesterol
00:02:09.19 fra forløberen acetyl CoA.
00:02:13.00Omdannelsen af acetyl CoA til kolesterol
00:02:15.0021 foregår ved hjælp af mere end 20 enzymer.
00:02:20.22Nu, som du kan forestille dig,
00:02:22.21 omfatter syntesen af kolesterol produktion af flere mellemprodukter,
00:02:26.2116og disse mellemprodukter kan i sig selv
00:02:29.14 også omdannes til meget vigtige slutprodukter.
00:02:33.11 For eksempel kan denne forbindelse, farnesylpyrofosfat,
00:02:36.1129er en forløber for en vigtig forbindelse kaldet dolichol,
00:02:40.25som er involveret i N-linked glycosylering.
00:02:43.26Det er også en forløber for hæm og ubiquinoner,
00:02:46.10som er involveret i celle respiration;
00:02:49.1026vitamin K, som er involveret i blodkoagulationen;
00:02:53.12og endelig bliver dette farnesylpyrofosfat og geranylgeranylpyrofosfat
00:02:58.06vedhæftet til mange signalproteiner,
00:03:01.16små GTP-proteiner,
00:03:03.22og leder dem til membraner,
00:03:06.12og denne modifikation er absolut nødvendig for normal cellefunktion.
00:03:03:13.04Nu viser dette dias, at syntesen af kolesterol
00:03:16.02er foregår i forskellige væv med forskellig hastighed.
00:03:19.29Leveren og binyrerne
00:03:23.14syntheserer nu det meste kolesterol i vores krop.
00:03:25.10Og jeg bør påpege, at dette faktisk blev gjort på mus,
00:03:28.06men lignende virkninger ses hos mennesker
00:03:31.07og andre primater.
00:03:33.19Leveren… leveren syntetiserer store mængder kolesterol
00:03:36.24for hovedsageligt produktion af lipoproteiner
00:03:39.14og også til galdesyresyntese.
00:03:42.10Nyrebarkhormonerne producerer kolesterol
00:03:45.28 primært til syntese af steroidhormoner,
00:03:48.13hvorimod tarmen syntetiserer kolesterol for at…
00:03:51.27til celledeling.
00:03:54.12Et stort antal celler i tarmen bliver skyllet af hver dag
00:03:57.12og skal erstattes af nye celler,
00:03:59.27hvilket kræver en markant mængde kolesterolsyntese.
00:04:03.28Jeg skal også påpege, at tarmen også er en kilde til produktion af lipoproteiner.
00:04:09.21Så nu er den anden kilde til kolesterol
00:04:12.12 faktisk fra de lipoproteiner
00:04:15.16der produceres af leveren og tarmen.
00:04:18.06Der er her vist en model af low-density lipoprotein.
00:04:23.02Det er den vigtigste kolesterolbærer i menneskeligt plasma.
00:04:28.02Low-density lipoprotein, eller LDL,
00:04:31.02Det er den vigtigste kolesterolbærer i menneskeligt plasma.
00:04:28.0214 består af en kerne, der er sammensat af frit kolesterol.
00:04:36.19Det hydrofobiske kolesterol udgør altså kernen i LDL-partiklen.
00:04:41.19Dette hydrofobiske kolesterol
00:04:44.01er omgivet af en skal, der består af en fosfolipid
00:04:47.02med forskellige mængder esterificeret kolesterol
00:04:51.13 – det er kolesterol, hvortil der er knyttet en fedtsyre —
00:04:55.13.14som er indlejret i fosfolipidskallen.
00:04:59.03Nu er hele denne LDL-partikel
00:05:02.18omgivet af et protein kaldet apolipoprotein B.
00:05:08.02Så, dette dias viser faktisk
00:05:10.17hvordan cellerne får kolesterol fra disse to kilder:
00:05:13.13endogen syntese og fra LDL.
00:05:18.19LDL-receptorer
00:05:21.09– de er på overfladen af cellerne —
00:05:23.09.20binder sig til LDL ved at interagere med denne apolipoprotein B-partikel
00:05:29.12som omgiver lipoproteinskallen.
00:05:32.25Når LDL-partiklen binder sig til LDL-receptoren,
00:05:35.27, internaliseres hele komplekset i coated pits.
00:05:05:40.06Og disse coated pits er derefter målrettet mod lysosomer,
00:05:05:43.07hvor LDL-partiklen nedbrydes, og kolesterolet
00:05:47.15 – frit kolesterol —
00:05:49.25 frigøres nu og stilles til rådighed for cellen til forskellige formål.
00:05:54.18Så, igen, disse to kilder til cellulært kolesterol
00:05:58.03 – enten fra receptoren… LDL-receptormedieret endocytose af LDL,
00:06:03.07eller gennem endogen syntese —
00:06:06.02kan bruges i flæng.
00:06:09.01Så hvis LDL f.eks. bliver begrænsende,
00:06:12.00skifter cellen over til endogen syntese for sine kilder til kolesterol.
00:06:18.02Og hvis den endogene syntese blokeres,
00:06:20.05så kan cellerne nu bruge eksogent LDL
00:06:23.01som kilde til kolesterol.
00:06:27.00Så vi har talt om kolesterols vigtige funktion.
00:06:30.10Det er vigtigt i cellemembraner.
00:06:32.11Det er en vigtig forløber for steroidhormoner
00:06:34.28og galdesyrer.
00:06:36.16Der er dog også en dårlig side af kolesterol,
00:06:38.13og det er illustreret på dette dias.
00:06:41.00I en årrække har forhøjede niveauer af LDL-kolesterol i blodet
00:06:46.14 været forbundet med en risiko for koronar hjertesygdom
00:06:49.19og hjerteanfald.
00:06:51.16Så her kan man se, at
00:06:54.27niveauet af kolesterol i blodet
00:06:57.26bogstaveligt talt korrelerer med risikoen for koronar hjertesygdom.
00:07:01.09Og det skyldes, at forhøjet kolesterol
00:07:04.21kan faktisk aflejre sig i de arterier, der fører til… til hjertet.
00:07:08.12Og med tiden resulterer denne aflejring
00:07:11.15i en sygdom kaldet åreforkalkning,
00:07:13.09 hvor denne aflejring af kolesterol
00:07:15.04kan føre til dannelse af plaques
00:07:17.04.12som i sidste ende kan blokere blodgennemstrømningen til hjertet,
00:07:19.18 hvorved der opstår et hjerteanfald.
00:07:23.06Nu er en af de mest almindeligt ordinerede lægemidler
00:07:28.16for at sænke LDL-kolesterol
00:07:31.11en gruppe af lægemidler kaldet statiner.
00:07:33.03Det er vist her den typiske kernestruktur af statinerne
00:07:37.26og nogle af de forskellige former for statiner
00:07:41.29der er blevet anvendt i klinikken.
00:07:44.22I årenes løb er statinerne
00:07:47.12 blevet et af de mest… den mest solgte medicin…
00:07:49.10medicin i USA
00:07:51.20på grund af deres evne til at sænke LDL-kolesterol i blodet.
00:07:57.19Så, vist i dette eksperiment er et resumé af mindst fire undersøgelser
00:08:02.23der viser, at statiner faktisk reducerer LDL-kolesterol
00:08:06.06og at denne reduktion fører til en reduceret forekomst
00:08:10.04af koronar hjertesygdom.
00:08:12.11Så, vist her i de lukkede cirkler er kliniske forsøg
00:08:15.11i hvilke patienterne enten blev behandlet med et statin, vist i… vist i de lukkede cirkler,
00:08:20.22eller placebo.
00:08:22.11og i hver af disse undersøgelser førte statinbehandlingen til
00:08:25.17 et fald i LDL-kolesterolniveauet,
00:08:28.11og i hver af disse undersøgelser førte statinbehandlingen til
00:08:25.17 et fald i LDL-kolesterolniveauet,
00:08:28.06og dette fald i LDL-kolesterolniveauet
00:08:31.19 førte til et fald i antallet af koronare hændelser, dvs. hjerteanfald.
00:08:35.13Så spørgsmålet er, hvordan virker statiner?
00:08:38.21Og hvad gør statiner?
00:08:40.21Og hvad gør statiner?
00:08:40.28Så, vi svarede først, hvad gør statiner?
00:08:43.16Så, statiner hæmmer enzymet HMG CoA reductase.
00:08:47.05HMG CoA reductase katalyserer
00:08:50.20det hastighedsbegrænsende trin i syntesen af kolesterol.
00:08:53.28Det er faktisk det fjerde trin i kolesterolsyntesevejen.
00:08:58.06Så statiner hæmmer HMG CoA reduktase konkurrerende
00:09:01.20ved at efterligne produktet af reduktasereaktionen,
00:09:05.13mevalonat.
00:09:07.1320Denne kompetitive hæmning af reduktasen
00:09:10.19underbygger statinernes evne til at nedregulere
00:09:14.18LDL-kolesterol i blodet.
00:09:18.07Så, hvordan virker statiner?
00:09:20.17Så, igen, ved at hæmme HMG CoA-reduktase på en kompetitiv måde,
00:09:24.01det fører til et fald i mængden af mevalonat
00:09:27.09og naturligvis til et fald i kolesterol.
00:09:30.18Denne kolesteroludtømning fører til en stigning
00:09:33.12i transkriptionen af genet
00:09:36.06som koder for LDL-receptoren.
00:09:37.25og som følge heraf øges antallet af LDL-receptorer på overfladen…
00:09:41.14især i levercellerne,
00:09:43.15og denne stigning i LDL-receptorer fører
00:09:48.01til en øget eller forbedret optagelse af LDL i blodet.
00:09:52.0125Og denne reduktion af LDL i blodet
00:09:55.26er ansvarlig for den lavere forekomst af koronar hjertesygdom
00:09:58.20 hos statinbehandlede patienter.
00:10:02.12Den kliniske virkning af statiner
00:10:05.26er imidlertid faktisk afsvækket af
00:10:09.26.06den kompenserende stigning i HMG CoA reduktase
00:10:11.10som følger med statinbehandling.
00:10:13.19Og det illustreres på dette dias.
00:10:15.13Dette er en immunoblot af HMG CoA reduktase protein
00:10:19.13.03i leveren af mus, der er blevet fodret med statin,
00:10:22.17eller endda i dyrkede celler
00:10:25.00der er blevet behandlet med statiner in vitro.
00:10:26.24Og som du kan se,
00:10:28.20 medfører statinbehandling en markant ophobning
00:10:31.00.09af HMG CoA reduktase.
00:10:33.10Og denne ophobning, som jeg nævnte tidligere,
00:10:35.24afbøder de kliniske virkninger af statiner.
00:10:38.12Så vores næste spørgsmål er, hvorfor statiner forårsager
00:10:41.27HMG CoA reduktase til at ophobe sig til et så højt niveau?
00:10:44.14Hvilket jeg bør påpege er blevet anslået til at være
00:10:47.02mindst 200 gange.
00:10:49.29Så normalt er HMG CoA reduktase
00:10:51.25underlagt en enorm feedbackregulering.
00:10:55.02Og denne feedback-regulering formidles delvist
00:10:57.29af steroler.
00:11:00.02Nu blokerer statinbehandling, som jeg nævnte tidligere,
00:11:02.05 HMG CoA reduktase-aktivitet,
00:11:04.12og det forhindrer syntesen af disse sterolmolekyler.
00:11:07.29Og selvfølgelig er denne forhindring af sterolsyntese
00:11:10.26 faktisk ansvarlig for opreguleringen af LDL-receptorerne
00:11:14.17og den efterfølgende reduktion af LDL-kolesterol.
00:11:11:18.09Men fordi statinerne
00:11:21.03 blokerer syntesen af steroler,
00:11:22.18 forstyrrer de imidlertid feedback-reguleringen af reduktasen.
00:11:25.14Og som følge heraf sker der tre ting.
00:11:27.28Først, på grund af denne reduktion af kolesterol
00:11:31.09og andre produkter fra kolesterolsyntetisk vej,
00:11:35.08der sker en øget transkription af reduktase-genet,
00:11:39.07der sker en øget translation
00:11:41.28af reduktase-mRNAet,
00:11:43.28og der sker en øget transkription af reduktase-genet,
00:11:43.17og endelig er der en øget stabilitet
00:11:45.24af reduktaseproteinet.
00:11:47.13Disse tre begivenheder er altså ansvarlige
00:11:49.19for den markante stigning i reduktaseproteinet
00:11:52.03, som jeg viste dig på det foregående dias.
00:11:55.18Så i løbet af årene har mit laboratorium været interesseret i at forsøge at forstå
00:11:59.27de molekylære mekanismer, der ligger til grund for
00:12:02.22denne øgede stabilitet af proteinet,
00:12:04.09og det vil være emnet for resten af denne præsentation.
00:12:09.16Dette dias viser, at steroler
00:12:13.08 faktisk fremskynder nedbrydningen
00:12:15.26af HMG CoA reduktase.
00:12:17.14Så i dette eksperiment,
00:12:19.11 anvendte vi klassisk pulse-chase analyse
00:12:20.29til at overvåge reduktasens stabilitet i celler
00:12:23.16der er blevet behandlet i fravær eller tilstedeværelse af steroler.
00:12:26.00Det vi gør her er, at vi typisk mærker celler med radioaktivitet,
00:12:29.00.27en lille delmængde af HMG CoA reduktase-molekyler.
00:12:33.25Vi fjerner så denne radioaktivitet,
00:12:35.25og følger så den præ…
00:12:37.25stabiliteten af reduktaseproteinet
00:12:39.26i fravær eller tilstedeværelse af steroler.
00:12:44.10Og som du kan se her,
00:12:46.08når cellerne jagtes i medier
00:12:49.07der ikke indeholder radioaktivitet,
00:12:51.01i fravær af steroler
00:12:52.28er reduktasen forholdsvis stabil over tid.
00:12:55.16Hvorimod, som du kan se,
00:12:57.21tilsætningen af steroler i jagtmediet
00:12:59.26forårsager, at reduktase-niveauerne falder markant.
00:13:02.20Det er igen tegn på sterol-accelereret nedbrydning
00:13:06.04af HMG CoA reduktase.
00:13:09.16Nu skal man for at forstå de molekylære mekanismer
00:13:11.16forstå de molekylære mekanismer
00:13:11.22for denne sterol-inducerede nedbrydning af reduktasen,
00:13:14.15skal vi forstå strukturen af HMG CoA reduktaseproteinet.
00:13:18.05Og reduktasens domænestruktur
00:13:20.05og domænestrukturen af reduktasen
00:13:20.14er faktisk illustreret på dette dias.
00:13:22.18Så HMG CoA reduktase
00:13:24.16 består af to forskellige domæner.
00:13:26.28Det har et N-terminalt domæne
00:13:29.06som forankrer proteinet i membranerne i det endoplasmatiske retikulum,
00:13:32.14eller ER.
00:13:35.00Nu er dette N-terminale domæne,
00:13:36.29som vi kalder membrandomænet,
00:13:39.04indeholder otte membranoverskridende regioner.
00:13:42.05Og det efterfølges af det andet domæne af HMG CoA reduktase,
00:13:45.07som vi kalder det katalytiske domæne.
00:13:47.24Det katalytiske domæne stikker altså ud i cellens cytosol
00:13:51.24og indeholder al HMG CoA-reduktasens enzymatiske aktivitet.
00:13:56.03En trunkeret version af reduktasen
00:13:59.29som kun indeholder det katalytiske domæne
00:14:02.13kan fuldstændig redde syntesen af mevalonat
00:14:06.28i celler, der mangler HMG CoA reduktase.
00:14:10.13Det katalytiske domæne er altså både nødvendigt og tilstrækkeligt
00:14:13.01for syntesen af mevalonat.
00:14:15.29Hvilket så rejser spørgsmålet,
00:14:17.28hvorfor er dette protein membranbundet?
00:14:19.26Og det viser sig, at reduktase
00:14:22.02 faktisk er et membranbundet protein så langt tilbage som i gær.
00:14:25.18Så, funktionen af reduktasens membrandomæne
00:14:28.26blev illustreret i dette tidlige eksperiment
00:14:31.27der sammenlignede stabiliteten af det katalytiske domæne
00:14:35.08 – som, husk det, indeholder al enzymatisk aktivitet —
00:14:37.26med enzymet i fuld længde.
00:14:40.20Og igen blev en simpel pulse-chase-analyse
00:14:42.21brugt til at overvåge stabiliteten af disse to proteiner.
00:14:47.13Som du kan se i panelet til venstre,
00:14:49.03producerer det afkortede katalytiske domæne
00:14:53.14et meget stabilt protein, der… vigtigt,
00:14:57.08deres nedbrydning ikke påvirkes af steroler.
00:14:59.20I modsætning hertil er proteinet i fuld længde – som igen indeholder membrandomænet –
00:15:03.07 mindre stabilt, selv i fravær af steroler.
00:15:06.13Og man kan se, at steroler markant fremskynder
00:15:09.25nedbrydningen af HMG CoA reduktase,
00:15:12.09hvilket indikerer, at membrandomænet…
00:15:15:15.12membrandomænets funktion
00:15:17.25er for denne sterol-accelererede eller sterol-inducerede nedbrydning.
00:15:22.08Så, hvad de tidligere undersøgelser indikerede
00:15:25.12er, at reduktasens membrandomæne
00:15:28.03er nødvendigt og tilstrækkeligt til sterol-accelereret nedbrydning,
00:15:30.25og de antydede, at membrandomænet,
00:15:33.16 enten direkte eller indirekte,
00:15:35.16kan registrere intracellulære niveauer af steroler.
00:15:38.00Og registreringen resulterer i, måske,
00:15:41.02en konformationsændring i reduktase-membrandomænet
00:15:43.29som gør proteinet modtageligt for hurtig nedbrydning.
00:15:48.14Og fordi statinerne blokerer for kolesterolsyntesen,
00:15:52.01blokerer statinerne naturligvis denne
00:15:54.22hvad vi kalder ER-associeret nedbrydning — eller ERAD —
00:15:57.08af HMG CoA reductase.
00:16:02.23Så et vigtigt gennembrud i vores forståelse
00:16:04.23af ERAD af HMG CoA reduktase
00:16:06.15kom med opdagelsen af et par proteiner
00:16:08.28– ER-membranproteiner —
00:16:10.23 kaldet Insig-1 og Insig-2.
00:16:14.15 Disse Insig-proteiner er i forbindelse med dette foredrag
00:16:16.27 meget overflødige.
00:16:18.14De udfører redundante roller i nedbrydningen, eller ERAD,
00:16:22.06af HMG CoA reductase.
00:16:24.00De er identiske… de er omkring 85 % identiske,
00:16:26.23og de er meget hydrofobiske proteiner.
00:16:29.24Nu blev Insigs rolle i ERAD af HMG CoA reductase
00:16:34.28 først illustreret i dette eksperiment.
00:16:37.19Så, her brugte vi igen pulse-chase analyse
00:16:40.15til at måle den sterol-accelererede nedbrydning
00:16:43.29af reduktasen i celler
00:16:47.02der enten var transficeret med kontrolmolekyler,
00:16:51.06kaldt siRNA’er,
00:16:53.05eller celler, der var transficeret med siRNA’er
00:16:55.26som ville føre til nedbrydning af ekspressionen
00:16:58.13af både Insig-1 og Insig-2.
00:17:02.07Og som du kan se i panelet til venstre,
00:17:04.13i de celler, der er transficeret med kontrol siRNA’erne,
00:17:08.04 fremskynder steroler markant nedbrydningen
00:17:12.07af HMG CoA reduktase.
00:17:14.13Så, åbne cirkler er eksperimenter udført i fravær,
00:17:17.09og de lukkede cirkler er eksperimenter udført
00:17:20.15i tilstedeværelse af steroler.
00:17:17:22.12Og hvad man let kan se, er, at knockdown af Insig-1 og Insig-2
00:17:26.23 helt afskaffer sterol-accelereret nedbrydning,
00:17:30.02 hvilket indikerer, at disse proteiner
00:17:32.28 spiller en nøglerolle i processen.
00:17:35.27Så vores næste spørgsmål er,
00:17:38.02hvad er den mekanisme
00:17:39.26 hvormed insigerne fremskynder ERAD af HMG CoA reduktase?
00:17:47.09Så, dette eksperiment…
00:17:48.21Dette dias viser, at inhibitorer af proteasomet, 26S proteasomet,
00:17:53.21blokerer den sterolinducerede nedbrydning af HMG CoA reduktase.
00:17:57.15Så, som du kan se i dette eksperiment…
00:18:00.18i de to første baner, fik steroler reduktasen til at blive markant nedbrudt,
00:18:04.17og denne nedbrydning er fuldstændig blokeret
00:18:06.19når disse celler behandles med proteasomhæmmeren.
00:18:12.03Så, med… dette giver os mulighed for at skabe en anden model
00:18:15.27i hvilken, igen, reduktasens membrandomæne
00:18:18.25 enten direkte eller indirekte
00:18:21.22følger niveauerne af intracellulære steroler,
00:18:24.Dette får reduktasen til at binde sig til Insig,
00:18:28.12og denne Insig-binding fører til reaktioner, der får reduktasen
00:18:32.06til nu at blive nedbrudt af 26S-proteasomet.
00:18:37.22Nu er det kendt, at de fleste af proteasomernes substrater
00:18:41.00kræver deres forudgående ubiquitinering.
00:18:44.05Ubiquitinering er en proces, hvorved
00:18:46.23det lille protein ubiquitin bliver kovalent knyttet
00:18:50.16til substratmolekyler.
00:18:52.08Og når først en kæde af ubiquitiner
00:18:54.16er knyttet til substrater,
00:18:56.08, bliver den genkendt af proteasomerne med henblik på nedbrydning.
00:19:00.25Nu kaldes dette polyubiquitinering,
00:19:02.25og polyubiquitinering af proteiner
00:19:05.14kræver mindst tre forskellige typer enzymer.
00:19:07.29Det er illustreret på dette dias.
00:19:11.09I det første trin,
00:19:13.15 bliverubiquitin aktiveret
00:19:15.20på en ATP-afhængig måde af et enzym kaldet E1,
00:19:19.11eller ubiquitin-aktiverende protein.
00:19:22.15I det næste trin overføres ubiquitin fra E1 til…
00:19:27.13til et andet enzym kaldet E2, eller ubiquitin-konjugerende enzym.
00:19:32.16I det sidste trin kombineres E2 med en E3,
00:19:36.24eller ubiquitinligase,
00:19:39.08som igen er forbundet med substratet,
00:19:42.09vist her i grønt.
00:19:44.11Hvad E3 gør er, at det letter overførslen af ubiquitin
00:19:47.27fra det ubiquitin-konjugerende enzym
00:19:50.27.00til en lysinrest i substratproteinet,
00:19:53.08og danner et ubiquitineret substrat.
00:19:57.28Nu sker denne proces mange gange,
00:20:00.02 indtil en ubiquitinkæde er bygget op på substratproteinet.
00:20:06.02Det kan nu genkendes af proteasomerne med henblik på nedbrydning.
00:20:10.18Så i betragtning af, at disse Insig-proteiner
00:20:12.26er nødvendige for nedbrydning af reduktase,
00:20:15.08og at reduktase faktisk nedbrydes af proteasomer,
00:20:19.02 er vores næste spørgsmål, om reduktase er ubiquitineret?
00:20:23.20Det spørgsmål blev besvaret i dette eksperiment
00:20:26.11vist på dette dias.
00:20:28.21Så, hvad vi har gjort i dette eksperiment er, at vi har behandlet celler
00:20:31.15i fravær og tilstedeværelse af steroler
00:20:33.20og proteasomhæmmeren.
00:20:37.05Efter disse behandlinger,
00:20:39.11immunudfælder vi reduktasen
00:20:41.11.21og derefter undersøge disse immunoprecipitater for enten total reduktase,
00:20:43.20vist på det nederste panel,
00:20:45.18eller ubiquitinated reduktase.
00:20:49.07Så, som du kan se i den første bane,
00:20:51.01 selv om reduktase er trukket ned i disse eksperimenter,
00:20:55.11 ser vi ingen reaktivitet med ubiquitinering.
00:20:58.14Derimod får steroler reduktasen til at blive ubiquitineret.
00:21:03.09Og denne ubiquitinering øges markant
00:21:07.22hvis vi også medtager proteasomhæmmere.
00:21:09.27Så, det, som dette indikerer for os, er, at steroler
00:21:12.16 faktisk får reduktasen til at blive ubiquitineret,
00:21:14.20og dette ubiquitinerede protein bliver nu nedbrudt af proteasomer,
00:21:17.18som det fremgår af stabiliteten af ubiquitineret reduktase
00:21:21.21ved disse proteasomhæmmere.
00:21:24.27Vores næste spørgsmål er,
00:21:27.07er Insigs nødvendige for denne sterol-inducerede ubiquitinering af reduktasen?
00:21:32.16Og igen vender vi os til siRNA’er.
00:21:35.08Celler blev transficeret enten med kontrol siRNA
00:21:38.08Og igen, vi vender os til siRNA’er.
00:21:35.08Celler blev transficeret enten med kontrol siRNA
00:21:38.18eller siRNA’er mod Insig-1 og -2.
00:21:41.03Vi behandler derefter disse celler i fravær eller tilstedeværelse af steroler,
00:21:43.20og undersøger derefter for ubiquitinated reductase.
00:21:47.16Og som du kan se i de to første baner,
00:21:49.10 er reduktasen pænt ubiquitineret i tilstedeværelse af steroler,
00:21:52.08og knockdown af Insig-1 og Insig-2
00:21:56.02 ophæver fuldstændigt denne ubiquitination.
00:22:01.01Så det giver os nu mulighed for at udfylde flere huller i vores model
00:22:04.07for Insig-medieret ERAD af HMG CoA reduktase.
00:22:09.14Nu viser det sig, at en undergruppe af Insig-molekyler
00:22:12.00 faktisk associerer sig med et E3/E2 ubiquitinligase-kompleks.
00:22:16.27Igen, i tilstedeværelse af steroler,
00:22:20.15reduktasens membrandomæne
00:22:23.03følger sterolen,
00:22:24.25og denne følgeskab får reduktasen til at binde sig til Insigs,
00:22:27.28og disse Insigs
00:22:31.13danner derefter brobygning mellem reduktasen og E3/E2 ubiquitinligasekomplekset.
00:22:36.26Denne brobygning resulterer derefter i ubiquitinering af reduktasen
00:22:40.00på to lysinrester i membrandomænet.
00:22:43.17Og denne ubiquitinering bevirker så, at reduktase
00:22:46.17 bliver fjernet fra ER-membranen
00:22:50.09og efterfølgende nedbrudt af proteasomer,
00:22:52.22 gennem en proces, som vi ikke er helt…
00:22:55.07 gennem en proces, som ikke er helt forstået.
00:23:00.20Så, kort sagt, jeg har fortalt jer i dag
00:23:03.16at HMG CoA reduktase er det hastighedsbegrænsende enzym
00:23:06.07i den syntetiske kolesterolvej,
00:23:08.01og det er et mål for disse kolesterolsænkende statinmedicin.
00:23:11.26Reduktasen styres gennem et meget komplekst
00:23:15.16feedback-reguleringssystem
00:23:18.01 , der formidles af kolesterol og andre typer steroler.
00:23:20.18Og at statinerne forstyrrer dette feedback-reguleringssystem,
00:23:24.03delvis ved at blokere denne Insig-medierede ubiquitination
00:23:27.10og ERAD af HMG CoA reductase.