Plasmidmedieret AmpC β-laktamase CITM- og DHAM-gener blandt Gram-negative kliniske isolater

Baggrund

Drugresistens blandt nogle af de Gram-negative bakterier (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii og Pseudomonas aeruginosa) er opstået og spredt over hele verden. Blandt Enterobacterales-familien er Escherichia coli og Klebsiella spp. hyppigt isolerede organismer, som har bemærkelsesværdige lægemiddelresistensegenskaber. β-lactamer er de almindeligt ordinerede lægemidler mod disse genstridige stammer og udgør alene ca. to tredjedele af de seneste kliniske recepter.1 Denne gruppe indeholder fire store kemiske klasser: penicilliner, cefalosporiner, carbapenemer og monobactamer, hvor carbapenemer anvendes som sidste udvej i den empiriske behandling mod patogene stammer af grampositive, gramnegative og anaerobe bakterier.2

Resistens over for β -lactamer kan tilskrives produktionen af β-lactamaser, disse hydrolytiske enzymer, som er i stand til at inaktivere antibiotika, inden de når penicillinbindende proteiner (PBP’er), der er placeret på cytoplasmamembranen.3 De vigtigste β-lactamasefamilier omfatter plasmidmedierede extended-spectrum β-lactamaser (ESBL’er), AmpC, cephalosporinaser og carbapenemase. Alle klasser er blevet påvist globalt med få af dem koncentreret i bestemte lande.1

Generne, der koder for AmpC β-lactamase, har spredt sig meget og påvises i vid udstrækning i bakterielle plasmider. Den første plasmidkodede AmpC-variant blev først identificeret i 1989 fra Klebsiella pneumoniae isoleret i Sydkorea. Den fik navnet CMY-1 på grund af dens fænotypiske træk i forbindelse med cephamycinase og var notorisk resistent over for cefoxitin.4,5 I løbet af kort tid blev der påvist mange familier af plasmidmedierede AmpC-varianter, fortrinsvis fra isolater af K. pneumoniae og E. coli. Bakterier med plasmidmedierede AmpC-genotyper blev henført på grundlag af homologi i nukleinsyresekvensen, hvorved der blev dannet et større antal bakterieslægter, der fungerede som kilde til disse plasmider og en række AmpC-familier.6 Til dato er følgende AmpC-familier blevet rapporteret globalt: to familier af CMY β-lactamaser (CMY-1 og CMY-2) isoleret fra henholdsvis Aeromonas hydrophila og Citrobacter freundii; enzymer af FOX- og MOX-typen isoleret fra Aeromonas spp.; ACC-familien stammer fra H. alvei; LAT-familien af cefalosporinaser isoleret fra C. freundii; MIR- og ACT-familierne stammer fra Enterobacter spp.; og DHA-familien isoleret fra Morganella morganii.4,6,7 Størstedelen af plasmidkodede AmpC-gener findes i isolater af E. coli og K. pneumoniae i nosokomiale infektioner, mens resistens blandt andre gramnegative bakterier såsom E. cloacae, C. freundii, S. marcescens og M. morganii opnås ved hjælp af kromosomformidlede AmpC β-lactamaser, hvilket øger resistensen over for bredspektrede cefalosporiner8 . De organismer, der producerer ESBL’er, som ofte er karakteriseret ved samekspression med AmpC β-lactamaser, udgør en alvorlig trussel i forbindelse med diagnosticering og behandling af patogenerne.

Dertil kommer, at AmpC β-lactamasegener, især MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM og ACCM, er ansvarlige for udviklingen af bredspektret resistens over for de fleste β-lactamer (bortset fra cefepim og carbapenemer). Desuden kan erhvervelse af disse gener i bakterierne yderligere øge resistensen, fordi inhibitorer af klasse A-enzymer (herunder clavulansyre, sulbactam og tazobactam) og p-chloromercuribenzoat ikke er effektive mod AmpC β-lactamaser, selv om nogle af dem kan hæmmes af tazobactam eller sulbactam6 .

Selv om der gøres en indsats for at bremse væksten og spredningen af lægemiddelresistente patogener, er undersøgelserne af AmpC β-lactamaser i ressourcebegrænsede miljøer stadig utilstrækkelige. Det vigtigste skridt i håndteringen af den stigende antimikrobielle resistens (AMR) er den præcise påvisning af patogene (og/eller resistente) stammer i diagnostiske laboratorier. Ikke desto mindre giver laboratorieprotokollerne til rutinerapportering ikke det præcise resultat i Nepal, fordi AmpC β-lactamaserne er vanskelige at identificere ved hjælp af fænotypiske test alene og ofte fejlagtigt påvises som ESBL’er i kliniske laboratorier. Enterobacterales-isolater, som er positive ved screeningtest af ESBL-fænotype, men negative ved konfirmatorisk test, betragtes normalt som potentielle producenter af AmpC β-lactamaser, der enten skyldes kromosomal depression eller plasmidoverførsel.9

Selv de erfarne kliniske mikrobiologer kan ikke identificere plasmidmedieret AmpC β-lactamase, hvilket tyder på, at der er behov for en mere præcis og specifik metode til hurtig påvisning. Nogle af disse procedurer er imidlertid ressourcekrævende og kræver ofte reagenser, som ikke er let tilgængelige.10 Af disse grunde bliver AmpC β-lactamaser ikke opdaget i kliniske prøver. Der er således blevet udviklet en mere pålidelig og gyldig laboratorieprotokol bestående af multiplex polymerasekædereaktion (PCR) for at lette diagnosen af plasmidkodede AmpC-gener, som er ansvarlige for AmpC β-lactamasekspression i forskellige kliniske infektioner.11

De fleste undersøgelser er fokuseret på prævalensen af ESBL-enzymer i Gram-negative kliniske isolater i Nepal.12-16 Der er et begrænset antal undersøgelser af AmpC β-lactamasenzymer i Gram-negative bakterier i Nepal. En undersøgelse udført i Kathmandu-dalen rapporterede 27,8 % af Enterobacterales-isolater som AmpC β-lactamaseproducenter ved hjælp af fænotypisk metode.17 Så vidt vides er der begrænsede undersøgelser vedrørende påvisning og karakterisering af AmpC β-lactamaseenzymer i Gram-negative bakterier ved hjælp af både fænotypiske og genotypiske metoder i Nepal. Det er vigtigt at opstille standardfænotypiske og genotypiske metoder til antibiotikafølsomhedstest for at screene lægemiddelresistente patogener på hospitaler. Denne undersøgelse blev foretaget for at isolere og identificere AmpC β-lactamasegener (blaCITM og blaDHAM) i Gram-negative bakterieisolater ved hjælp af både fænotypisk screening og konfirmatoriske metoder.

Metoder

Studie design

Dette er en hospitalsbaseret tværsnitsundersøgelse, der blev udført fra juni 2017 til januar 2018 på Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). I alt 1151 ikke-duplikerede kliniske prøver blev indsamlet og blev behandlet i løbet af undersøgelsesperioden. Prøverne omfattede urin (n=412), blod (n=206), kateterspids (n=163), pus (n=132), afføring (n=89), CSF (n=53), sårsvaber (n=58) og vaginal svaber (n=38). Prøverne blev udtaget i en steril, velmærket og lækagesikker beholder; og behandlet så hurtigt som muligt.18 Alle de besøgende patienter, der var mistænkt for at have bakterieinfektioner, og som gav deres samtykke til at blive inddraget, blev inkluderet i undersøgelsen. Studiedeltagere med utilstrækkelige demografiske oplysninger blev ekskluderet.

Kultur af prøver og identifikation af isolaterne

Prover blev indsamlet i henhold til standardiserede mikrobiologiske retningslinjer for indsamling af urin, afføring, pus, blod, CSF og kateterspids. Prøver, der kom i betragtning, blev yderligere inokuleret på blodagar (BA), chokoladeagar (CA) og MacConkey agar (MA). Desuden blev urinprøverne inokuleret i chromogen UTI-agar. Isolaterne blev identificeret ved hjælp af mikrobiologiske standardparametre såsom koloniernes morfologiske udseende, farvningsreaktioner og biokemiske egenskaber.19,20

Antibiotikafølsomhedstest

Alle identificerede gramnegative isolater blev yderligere underkastet in vitro antimikrobiel følsomhedstest ved hjælp af modificeret Kirby-Bauer diskdiffusionsmetode.21 For det første blev der fremstillet inokulater ved at overføre bakteriekolonier fra næringsagar til steril normal saltvand. Turbiditeten af inokulerne blev fastsat til 0,5 McFarland-standard som beskrevet i CLSI-retningslinjerne. Tæppekulturen af testinokulerne blev også fremstillet på Muller-Hinton agar (MHA). Antibiotikadisketter (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, Indien) blev anvendt i følgende proportioner: amoxicillin (10 μg), azithromycin (10 μg), amikacin (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitin (30 μg), ceftazidim (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), imipenem (10 μg), piperacillin/tazobactam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), cotrimoxazol (25 μg) og cefepim (30 μg). Den inokulerede plade blev inkuberet aerobt ved 37 °C i op til 18 timer. Efter tilstrækkelig inkubation blev hæmningszonerne (ZOI) omkring pladerne målt, og resultatet blev klassificeret som følsomt, intermediært eller resistent.21 Isolater, der udviste resistens over for tre eller flere antibiotika af forskellige klasser, blev fortolket som multidrugresistente.22

Screening for AmpC β-lactamaser

Isolaterne blev først screenet for mulig produktion af AmpC β-lactamaser i henhold til CLSI-retningslinjerne, 2019.23 Til screening blev ceftazidim eller cefotaxim eller cefoxitin eller ceftriaxon, hver på 30 µg, underkastet i AST-testning, og organismer, der var resistente over for disse antibiotika (der viste en hæmningszone med en diameter ≤ 18 mm), blev screenet som potentielle AmpC-producenter og underkastet yderligere konfirmatoriske test.

Bekræftelse for AmpC β-lactamaser

Screening af positive AmpC β-lactamaseproducenter blev bekræftet ved AmpC-disk-test og inhibitorbaseret konfirmationstest (boronsyretest).

I boronsyretest blev tæppekulturen af testorganismen fremstillet på MHA-plade med 0,5 McFarland-løsninger. To cefoxitinskiver (30 µg), hvoraf den ene var tilsat phenylborsyre (400 µg), blev anbragt på tæppekulturen på MHA-pladen og inkuberet, hvorefter resultaterne blev fortolket. Hvis der var en forøgelse af hæmningszonen med ≥5 mm, når den ønskede antibiotikadisk (ceftazidim eller cefotaxim) blev vurderet i kombination med phenylborsyre end under testen uden kombinationen (antibiotikadisk alene), blev isolatet markeret som havende positiv konfirmationstest.

I diskapproximationstesten blev diskene lagt over tæppekulturen af E. coli ATCC 25922. 30μg ceftazidimskive blev anbragt i midten af pladen efterfulgt af 10μg imipenem, 30μg cefoxitin og 20/10μg amoxicillin/clavulanatskiver, som blev anbragt i en afstand på 20 mm fra ceftazidimskiven. Kolonierne af testorganismen blev tilsat til en skive, hvorefter pladen blev vendt og inkuberet i 24 timer ved 37 °C aerobt. Enhver indrykning eller udfladning af ZOI indikerede isolaternes produktion af AmpC β-lactamase.20,24

Konservering af AmpC β-lactamasepositive isolater

Glycerol-stockpræparationsmetoden blev anvendt til konservering. Organismer blev konserveret i Tryptic Soy Broth (TSB) indeholdende 40 % glycerol og opbevaret ved -20ºC.25

Rå Plasmid DNA-udtrækning

En isoleret koloni af testorganismen blev inokuleret i Luria Bertani (LB) bouillon. Inokulumet blev inkuberet aerobt ved hjælp af en shaker i vandbad ved 37 °C i 18-24 timer. Den således opnåede renkultur blev underkastet alkalisk analyse for at ekstrahere plasmid-DNA. Det ekstraherede plasmid-DNA blev derefter suspenderet i TE-buffer og opbevaret ved -20 °C indtil yderligere undersøgelser.26

Amplifikation af AmpC β-lactamase generne (blaCITM og blaDHAM) ved PCR

AmpC β-lactamase generne (blaCITM og blaDHAM) blev amplificeret ved PCR ved hjælp af plasmid-DNA-præparatet som skabelon. De anvendte primere for blaCITM-genet var CLR5-F (5ʹ TGG TGG CCA GAA GAA CTG ACA ACA GGC AAA -3ʹ) og CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG CTG AAC GTG GTG GCT GGC -3ʹ) som henholdsvis fremadrettet og omvendt primer, mens primerne til blaDHAM-genet var fremadrettet sekvens DHAM for (5ʹ AAC TTT CTG CAC AGG TGT TGT GCT GGG -3ʹ) og omvendt sekvens DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA GCA TAC TGG TGG CTT TGC -5ʹ).11 Reaktionsvolumen blev fastsat til 25 µL ved at tilsætte 12,5 µL af 1X master mix (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estland), 0,5 µL af hver af de fremadrettede og omvendte primere og 4 µL DNA-template og ddH2O 7,5 µL. Den optimerede PCR-amplifikation af begge gener var 94ºC i 3 minutter til indledende denaturering; 35 cyklusser med denaturering ved 94ºC i 30 sekunder; 25 cyklusser med annealing ved 62ºC i 30 sekunder; 35 cyklusser med forlængelse ved 72ºC i 1 minut; og endelig forlængelse ved 72ºC i 7 minutter.11,27

Rensning af DNA

Plasmid DNA blev renset ved ethanoludfældningsmetoden. Ved denne metode blev DNA-pellet skyllet med iskold 70% ethanol og efterladt til tørre i 10 minutter, hvilket letter alkoholfordampningen. DNA-pellet blev suspenderet i en bufferopløsning indeholdende Tris, EDTA og RNaser for at udvaske de resterende urenheder.

Detektion af PCR-produkter ved gelelektroforese

De amplificerede produkter blev visualiseret ved hjælp af gelelektroforese i 1,5 % agarosegel farvet med 0,1 µL ethidiumbromid. Efter gelpræparationen blev 2 µL af 100bp DNA-stigen tilsat til den første brønd som markør, 2 µL af negativ kontrol blev tilsat til en anden brønd, 2 µL af positiv kontrol blev tilsat til en anden brønd og 2 µL af PCR-produkter blev tilsat til de resterende brønde. Endelig blev gelen visualiseret under UV-trans-illuminator.28

Kvalitetskontrol

Der blev anvendt en standard aseptisk procedure til procedurerne i denne undersøgelse. Alle partier af kulturmedier og kemiske reagenser blev behandlet med aseptiske teknikker i overensstemmelse med CLSI-retningslinjerne. I AST blev kvalitetskontrollen opretholdt ved at anvende kontrolstammer af E. coli ATCC 25922. Under PCR blev kvalitetskontrollen sikret ved at anvende Klebsiella-isolater, der var bærere af begge de pågældende gener, mens der blev fremstillet blanke eller negative kontroller uden anvendelse af nukleinsyrer. Alle disse kontroller blev anvendt i hvert batch af PCR-assayet.

Statistisk analyse

Data blev indtastet og analyseret ved hjælp af SPSS-software version 24.0. Sammenhængen blev undersøgt ved hjælp af Chi-squared tests ved 95% konfidensinterval (CI) blandt demografiske variabler såsom køn og alder af forsøgspersonerne.

Resultater

Demografisk og klinisk karakter af de tilmeldte patienter

Af de 1151 tilmeldte patienter var 54,2% (624/1151) mænd og 45,8% (527/1151) kvinder. Af 253 bakterievækst var 47,8 % (121/253) fra mænd og 52,2 % (132/253) fra kvinder. Af den samlede bakterievækst (253) var 26,1 % (66/253) fra urinprøver, efterfulgt af kateterspidser (17,4 %; 44/253), blod (16,2 %; 41/253), pus (11,9 %; 30/253) og sårsvaberprøver (10,7 %; 27/253). Ved aldersfordeling af patienterne blev den højeste vækst af bakterielle patogener fundet i aldersgruppen 16-45 år (39,5 %; 100/253) efterfulgt af henholdsvis 46-60 år (30,1 %; 76/253), >60 år (24,1 %; 61/253) og 0-15 år (6,3 %; 16/253) (tabel 1).

Tabel 1 Demografisk og klinisk karakter af patienter, der behandles på Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Fordeling af bakterieisolater i kliniske prøver

I alt 1151 kliniske prøver, 22% (253/1151) viste vækst på kulturmedier. Af 253 bakterieisolater var de fleste (89,3 %; 226/253) gramnegative bakterier. Blandt bakterievæksten var E. coli (28,5 %; 72/253) den fremherskende organisme efterfulgt af Pseudomonas aeruginosa (16,2 %; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8 %; 40/253), Gram-positive bakterier (10,7 %; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9 %; 25/253) og Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Figur 1)

Figur 1 Fordeling af bakterieslægter i dyrkningspositive kliniske prøver (n=253).

Antibiotikafølsomhedsmønster hos isolerede gramnegative bakterier

Ud af 226 gramnegative bakterieisolater var 66.8 % (151/226) blev fundet resistente over for cefoxitin, efterfulgt af ceftazidim (58,4 %; 132/226), ciprofloxacin (53,5 %; 121/226) og cefepim (51.8%; 117/226), mens isolaterne var mest modtagelige over for meropenem (69%; 156/226), ertapenem (68,6%;155/226), imipenem (66,8%; 151/226), amikacin (61,1%;138/226), piperacillin/tazobactam (56,6%;128/226) og azithromycin (53.1%; 120/226) (tabel 2) (tabel 2).

Tabel 2 Antibiotikafølsomhedsmønster for Gram-negative bakterieisolater (n=226)

Multidrug Resistance (MDR) Pattern in the Isolates

Af 226 isolater var 46.9 % (106/226) af isolaterne var MDR. Den højeste procentdel af MDR blev fundet blandt E. coli (31,1 %; 33/106) efterfulgt af henholdsvis P. aeruginosa (20,8 %; 22/106), A. baumannii (18,9 %; 20/106), K. pneumoniae (9,4 %; 10/106) og K. oxytoca (4,7 %; 5/106) (figur 2). For de enkelte arter blev den højeste procentdel af multiresistens fundet blandt C. freundii (100 %; 8/8) efterfulgt af henholdsvis P. aeruginosa (53,6 % 22/41), C. koseri (50 %; 2/4), A. baumannii (50 %; 20/40) og E. coli (45,8 % 33/72) (figur 2).

Figur 2 Fordeling af MDR-bakterier og samlet MDR % og MDR inden for hver art.

AmpC-detektion ved forskellige test

Ud af 226 Gram-negative isolater viste 50 % (113/226) resistens over for cefoxitin. AmpC β-lactamaseproducerende isolater blev bekræftet ved to forskellige bekræftelsestest, disk-test og boronsyretest. Af de 91 isolater viste 91,2 % (83/91) et positivt resultat i begge tests, og 8,8 % (8/91) af isolaterne viste kun positivt resultat i boronsyretesten, hvilket blev bekræftet ved mindst én test, og de blev betragtet som AmpC β-lactamaseproducenter.

Frekvens af blaCITM- og blaDHAM-gener i AmpC β-laktamaseproducerende gramnegative isolater

I PCR-analysen blev 90,1 % (82/91) og 87,91 % (80/91) af isolaterne testet positive for blaCITM og blaDHAM. Der blev henholdsvis påvist de amplificerede blaCITM- og blaDHAM-gener med deres ampliconstørrelse 465bp og 405bp (figur 3 og 4).

Figur 3 Agarosegelelektroforese (1,5 %) anvendt til adskillelse af PCR-produkter. Lane 2, positiv kontrol; Lane 3, 5 og 7 er CITM-positiv; Lane 4 og 6, CITM-negativ; og Lane 8. negativ kontrol.

Figur 4 Agarosegelelektroforese (1,5 %) anvendt til adskillelse af PCR-produkter. Lane 2, positiv kontrol; Lane 3, 4, 6 og 7 er Dham-positive; Lane 5, Dham-negativ; og Lane 8, negativ kontrol.

Fordeling af AmpC β-laktamase-, blaCITM- og blaDHAM-gener blandt Gram-negative isolater og deres relation til køn, alder, kliniske prøver og kliniske isolater

Ud af 91 AmpC-producenter var 50,6 % (46/91) af isolaterne fra kvindelige patienter og 49,4 % (45/91) fra mandlige patienter. Tilsvarende blev der opnået lige store andele (50 %; 41/82) blaCITM-gener fra prøver fra begge køn, mens der blev påvist 51,3 % (41/80) og 48,7 % (39/80) blaDHAM-gener i prøverne fra henholdsvis mandlige og kvindelige patienter. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem patientens køn og produktionen af AmpC-enzymer og AmpC-generne (tabel 3).

Tabel 3 Fordeling af AmpC β-laktamase-, CITM- og DHAM-gener blandt Gram-negative bakterieisolater og deres relation til køn, alder og kliniske prøver

Højeste antal AmpC β-laktamaseproducenter (40.7%; 37/91) og prævalens af isolater, der producerede blaCITM (40,2%; 33/82) og blaDHAM (41,2%; 33/80), blev opnået fra aldersgruppen (46-60) år efterfulgt af (16-45) år (30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) og 31,3%; 25/80) henholdsvis. Der var en signifikant sammenhæng mellem AmpC β-lactamase-enzymproduktion og aldersgruppe (p=0,01), mens andre faktorer, herunder erhvervelse af blaCITM- og blaDHAM-gener, ikke havde nogen signifikant sammenhæng med patientens alder (tabel 3).

I de kliniske prøver blev det højeste antal AmpC β-lactamasproducerende isolater (20,9 %; 19/91) påvist fra blod og kateterspidser, efterfulgt af urin (18,7 %; 17/91), pus (13,3 %; 12/91) og sårsvaberprøver (9,9 %; 9/91). Tilsvarende blev det højeste antal blaCITM- og blaDHAM-producerende isolater påvist fra kateterspidser (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80), efterfulgt af blod (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80), urin (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) og pus (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80), henholdsvis. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem kliniske prøver, AmpC β-lactamaseproduktion og generne: blaCITM og blaDHAM (tabel 3).

Distribution af AmpC β-lactamaser og erhvervelse af blaCITM- og blaDHAM-gener i forskellige gramnegative bakterier

Den højeste prævalens af AmpC β-lactamaseenzymer blev fundet i E. coli (28,6 %; 26/91), efterfulgt af P. aeruginosa (26,4 %; 24/91), A. baumannii (13,2 %; 12/91) og K. pneumoniae (10,9 %; 10/91). Den højeste prævalens af blaCITM- og blaDHAM-gener blev påvist hos E. coli (30,6 %; 25/82) (31,3 %; 25/80) efterfulgt af henholdsvis P. aeruginosa (25,7 %; 21/82), (22,5 %; 18/80) A. baumannii (12,2 %; 10/82), (12,4 %; 10/80) og K. pneumoniae (10,9 %; 9/82), (12,4 %; 10/80) (tabel 3).

Diskussion

Den stigende forekomst af antimikrobiel resistens er fortsat et af de største folkesundhedsproblemer i udviklingslande som Nepal29 , hvilket har ført til forlænget hospitalsophold, øgede behandlingsomkostninger, begrænsning af terapeutiske muligheder og øget morbiditet og dødelighed29,30 . Produktion af β-lactamaser er den vigtigste forsvarsmekanisme mod β-lactam-antibiotika. Denne undersøgelse blev udført for at undersøge tilstedeværelsen af Amber Class C β-lactamaser (AmpC) i Gram-negative organismer, der stammer fra kliniske prøver fra ANIAS, Kathmandu, Nepal. Undersøgelsen vurderede endvidere prævalensen af AmpC β-lactamasegener (blaCITM og blaDHAM) ved hjælp af PCR-assay. Vi fandt en høj prævalens af disse enzymer og gener, selv om prævalensen af sådanne enzymer varierede fra et geografisk område til et andet, inden for og mellem landene.

Ud af 1151 kliniske prøver viste kun 253 (21,9 %) en betydelig vækst af organismer. Af den samlede (253) bakterievækst var mere end halvfems procent gramnegative bakterier, og E. coli var de mest dominerende isolater blandt dem. Vores resultater stemmer overens med tidligere undersøgelser, der er rapporteret fra Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, Indien,36 Al-Najaf City, Irak,37 Shashemene Referral Hospital, Etiopien,38 og Mexico City, Mexico.39 Der blev observeret en lidt højere forekomst af Gram-negative bakterieinfektioner blandt kvindelige patienter, hvilket kan skyldes en højere prævalens af urinvejsinfektioner blandt kvinder. Dette stemmer overens med tidligere undersøgelser fra Model Hospital, Kathmandu,17 og Andra-Pradesh, Indien.40 I overensstemmelse med denne undersøgelse blev der rapporteret en højere forekomst af pusinfektioner i postoperative tilfælde hos kvinder (63,33 %) end hos mænd (43,75 %) i en undersøgelse udført i delstaten Uttar Pradesh i Indien.41

I denne undersøgelse udviste Gram-negative bakterieisolater større resistens over for følgende antibiotika: cefoxitin, ceftazidim, ciprofloxacin og cefepim, efterfulgt af cotrimoxazol, mens meropenem, imipenem, piperacillin-tazobactam og azithromycin blev rapporteret som de mest følsomme antibiotika. Et tilsvarende mønster blev observeret i nogle af de tidligere resultater fra Chitwan Medical College, Chitwan42 , Padma Hospital, Pokhara43 . Cefoxitin og ceftazidime med lav følsomhed er de førstevalgsmediciner, som let hydrolyseres af bakterieenzymerne og er mindre anvendelige til behandling af infektioner forårsaget af gramnegative patogener. I lighed med vores undersøgelse blev imipenem/meropenem fundet som de mest følsomme lægemidler i de tidligere undersøgelser fra Model Hospital, Kathmandu,17 Madrid Spanien,44 og Wisconsin, USA.45

Antimikrobiel resistens (AMR) med stigende spredning af MDR er et globalt problem, og dens virkninger er større i lav- og mellemindkomstlande, hvor byrden af infektionssygdomme er høj.30 Behandlingen af MDR-mikrober er dyr og vanskelig og forværres yderligere af den høje prævalens af nosokomiale infektioner.46 I denne undersøgelse viste næsten halvdelen af de isolerede Gram-negative isolater (46,9 %; 106/226) sig at være MDR. Højere prævalens af MDR-bakterier er blevet rapporteret fra nogle andre undersøgelser udført i Kathmandu46-49 og andre distrikter i Nepal.15,50,51 Produktion af ESBL, metallo β-lactamase (MBL) eller AmpC β-lactamase kan være årsagen til den reducerede modtagelighed over for den nyere generation af antibiotika.52 Desuden opstår multidrugresistens på grund af aggregering og ekspression af forskellige gener på resistente (R) plasmider eller gener, der koder for multidrug effluxpumper.53 Desuden er de gener, der er ansvarlige for ekspression af β-lactamaseenzymer, konstant forbundet med ikke-β-lactam antibiotika som aminoglykosider og fluoroquinoloner.

I denne undersøgelse blev AmpC-produktion fundet højere blandt mandlige patienter (41,67 %) end hos kvinder (38,98 %). Resultaterne af denne undersøgelse stemmer overens med nogle andre undersøgelser fra Kano, Nordvestnigeria.54 Vores resultater afviger dog fra undersøgelser rapporteret fra Benin, Nigeria.55 Højere prævalens af UTI med multidrugresistens blandt kvinder er blevet rapporteret af mange undersøgelser, dette kan skyldes højere prævalens af AmpC-producerende patogener blandt kvinder, da de er mere tilbøjelige til at få UTI end mænd.

Brug af cefoxitinresistens i diagnostiske laboratorier tjener som et pålideligt screeningsmiddel/markør til at påvise AmpC-produktion. Desuden giver denne markør en god negativ prædiktiv værdi.

På trods af deres brede anvendelsesområde har nogle af undersøgelserne understreget brugen af cefoxitin som et dårligt screeningsmiddel for AmpC-produktion. Dette kan skyldes eksistensen af andre alternative mekanismer end AmpC (en af dem er porinkanalmutation), som kan føre til falsk positiv fortolkning (som cefoxitinresistens).52 Vores undersøgelse viste, at en tredjedel af de Gram-negative isolater (>40%) var ansvarlige for AmpC-produktion. Resultaterne af denne undersøgelse stod i kontrast til undersøgelsen fra Model Hospital, Kathmandu.17 Forskellen kan skyldes den fænotypiske påvisningsmetode, der blev anvendt i denne undersøgelse, som anvendte cefoxitinresistens test og AmpC disk testmetode med cefoxitin (30 µg). Den konfirmatoriske test, der blev anvendt, var phenylboronsyretest med cefoxitin 30µg/400µg phenylboronsyre. Boronsyrederivater har vist sig at være reversible inhibitorer af AmpC β-lactamaseenzymer.56

I denne undersøgelse blev der observeret AmpC-produktion hos 91 (80,53 %) isolater ud af 113. AmpC-produktionsraten i vores undersøgelse er lidt højere end andre undersøgelser rapporteret fra Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 og Indien.59

For at kompensere for de begrænsninger, der skyldes en af metoderne, kan integration af begge teknikker i rutinediagnostik øge sensitiviteten og specificiteten af testene i de kliniske omgivelser.

I alt 73 Gram-negative isolater viste tilstedeværelsen af både blaCITM- og blaDHAM-gener. Disse resultater stemmer overens med en tidligere undersøgelse rapporteret fra Ilam, Iran.27 I en lignende type undersøgelse rapporteret fra Indien viste det sig, at blaCITM-gener var mere udbredt i E. coli.60 I vores undersøgelse blev prævalensen af AmpC-associerede gener (blaCITM og blaDHAM) undersøgt ved hjælp af fænotypiske og genotypiske metoder. Denne undersøgelse giver en bred analyse af de Gram-negative bakterier, der er associeret med AmpC β-lactamaseproduktion, og deres antibiotikafølsomhedsmønstre blandt kliniske isolater. Resultaterne af denne undersøgelse er vigtige for at få oplysninger om forskellige organismers resistensmønstre over for cefalosporiner. Overvågning af multidrugresistens med β-lactamase, herunder ESBL-, MBL- og AmpC-produktion, er nødvendig for en rutinemæssig klinisk praksis for at optimere behandlingen og forebygge yderligere resistens mod β-lactamantibiotika13,61,62

Stærke sider og begrænsninger

Dette er den første undersøgelse, der udforsker AmpC β-lactamasegener (blaCITM og blaDHAM) ved hjælp af både fænotypisk og molekylær test blandt patienter, der besøger et tertiært sundhedscenter i Nepal. Resultaterne af denne undersøgelse kan informere den antimikrobielle politik for tertiære sundhedscentre, herunder forberedelse af håndteringen af hospitalsinfektioner, behandlingsprotokol og diagnostisk procedure. Der er nogle få begrænsninger i denne undersøgelse, herunder undersøgelse af begrænsede AmpC β-lactamaser, kort varighed af undersøgelsen og gennemførelse på et enkelt tertiært plejecenter. Fremtidige undersøgelser kan bygge videre på den for at gennemføre en longitudinel undersøgelse på flere tertiære behandlingscentre med udforskning af alle β-lactamaser såsom ESBL, MBL, KPC og de vigtigste gener, der er ansvarlige for resistens. Ikke desto mindre vil denne undersøgelse som den første undersøgelse af sin art, der triangulerer de fænotypiske og molekylære metoder, være en værdifuld reference for fremtidige undersøgelser af AmpC β-lactamaser og prævalens af blaCITM- og blaDHAM-gener i andre omgivelser/hospitaler i Nepal.

Konklusion

Vores resultater viser, at reduceret modtagelighed for cefoxitin i Gram-negative isolater er forbundet med tilstedeværelsen af plasmidmedierede AmpC-gener. Da der mangler en enkelt definitiv metode, foreslås det at anvende flere fænotypiske påvisningsmetoder samtidig til præcis påvisning af AmpC β-lactamasproducerende bakterier. I denne undersøgelse påviste PCR næsten 90 % af AmpC β-lactamase-generne (blaCITM og blaDHAM) blandt fænotypisk bekræftede isolater. Den høje prævalens af resistente gener og MDR blandt Gram-negative isolater er et alarmerende tegn, der kræver hasteindgreb for at bremse væksten og spredningen af disse isolater.