Nylige anvendelser af bakteriesporer i nanobioteknologi

Sporer består af protein, har ordnede arrays af protomeriske underenheder, udviser selv-assemblering og har beskyttende egenskaber. Som hvilende metabolisk inaktive livsformer kan sporer overleve på ubestemt tid i en udtørret tilstand, og det er faktisk dokumenteret, at de har overlevet intakte i millioner af år . Sporen kan modstå temperaturer på op til 90 °C og kan modstå udsættelse for skadelige kemikalier . De fleste (men ikke alle) sporedannende bakterier tilhører to hovedslægter, Bacillus og Clostridium. Clostridia-sporebærere differentierer i modsætning til Bacillus kun under anaerobe forhold, hvilket gør Bacillus til den mest velegnede slægt til undersøgelse.

Bacillus-arter producerer en enkelt spore eller endospore (i modsætning til svampes exosporer) i bakteriecellen ved en differentieringsproces, der kræver koordineret handling af hundredvis af udviklingsgener . Typisk er modne sporer 0,8-1,2 μm lange og har enten en sfærisk eller ellipsoid form (se figur 1A). Det enkelte bakteriekromosom er kondenseret i midten af sporen, som kaldes kernen. Lag af lipidmembran og modificeret peptidoglykan omgiver sporkernen, men den vigtigste struktur er sporehuden. Denne laminerede proteinholdige skal giver sporerne modstandsdygtighed over for organiske opløsningsmidler og lysozym. I Bacillus subtilis findes der op til 25 forskellige kappeproteiner i to forskellige kappelag (figur 1B), den indre og den ydre kappe, men hos andre arter er der tegn på, at kappen er mindre kompleks og i nogle tilfælde kun består af nogle få proteintyper . Strukturen og samlingen af sporehætten er nu ved at blive et modelsystem til at forstå komplekse morfogenetiske samlingsprocesser i lighed med klassiske undersøgelser af fage T4-samlingen. Det ydre, elektrontætte lag af B. subtilis’ spormantel består af 5 hovedpolypeptider: CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) og CotF (8 kDa). CotA er en multi-kobberoxidase og kan ophobes i multimeriske former (observeret mikroskopisk) i de sporulerende celler i nogle kappe-defekte mutanter . CotA’s oligomerisering og selvsamling af CotA går formentlig forud for aflejring på sporernes kappeoverflade. CotG- og CotB-proteinerne har også vist sig at interagere kovalent, og desuden har CotG og CotC ekstremt usædvanlige aminosyresekvenser, der indeholder flere gentagelser (>13) af 12-13 aminosyrer, som er rige på lysiner og tyrosiner. Endvidere har mange af sporehindeproteinerne usædvanlige profiler, dvs. multimeriske former og afvigende molekylære masser, når de undersøges ved SDS-PAGE. For nylig er det blevet påvist, at sporehuden faktisk er fleksibel og kan udvide sig og trække sig sammen, og at denne egenskab er afgørende for dannelsen af sporer, når sporerne dehydrerer, og ligeledes for spiring, når sporerne rehydrerer. Dette aspekt af en selv-assembleret struktur er særlig interessant og kan give en række fremtidige anvendelser inden for lægemiddelafgivelse, nanofabrikation og overfladebelægninger.

Bakterielle endosporer. Panel A viser endosporer fra B. subtilis, hvoraf en af dem stadig er tilbageholdt i den stavformede “modercelle”. Hos B. subtilis er sporer ca. 1,2 μm lange og ellipsoide. Frigivne sporer har en klar beskyttende skal, der er kendt som sporehuden, og som består af op til 25 forskellige protomeriske komponenter, der er samlet i diskrete lag. Panel B viser en typisk SDS-PAGE (12,5 %) fraktionering af solubiliserede sporemantelproteiner, der afslører de fremherskende arter.

Engineering af bakteriesporemantel

En strategi til at manipulere Bacillus subtilis-sporer til at vise heterologe antigener på sporeoverfladen er for nylig blevet rapporteret og er illustreret i figur 2. Et sporebaseret display-system giver flere fordele i forhold til systemer baseret på anvendelse af bakterieceller, herunder bakteriesporens robusthed, der muliggør opbevaring i tørret form, nem produktion, sikkerhed og en teknologisk platform, der understøttes af omfattende værktøjer til genetisk manipulation.

Spore-overfladedisplay ved hjælp af proteiner fra sporernes kappe. B. subtilis-sporen består af en indre kerne (gul) omgivet af en peptidoglykanlignende cortex (rød) og en proteinholdig kappe, der er opdelt i en indre (grå) og en ydre (sort) del. Fusionsproteinet, der består af en bærerdel (blå) og en passagerdel (lilla), er eksponeret på sporeoverfladen.

I modsætning til de mange tilgængelige oplysninger om, hvordan genekspression styrer differentieringen af en voksende celle til en hvilende spore, er der kun lidt viden om mekanismerne for proteinindbygning i pelsen, arten af de strukturelle komponenter, der udgør den mest ydre del af pelsen, og om der er forankringsmotiver. De første forsøg på at eksponere heterologe proteiner på sporeoverfladen har været fokuseret på to kappekomponenter, CotB og CotC. For CotB’s vedkommende vides det, at dette protein i sporerens pels er placeret på overfladen, mens CotC i forhold til andre pelsproteiner har en høj relativ hyppighed i forhold til andre pelsproteiner. Observationen af, at begge disse kappekomponenter ikke var nødvendige for dannelsen af en tilsyneladende normal spore og for dens spiring, var et yderligere positivt træk ved valget af CotB og CotC som potentielle bæreproteiner.

To antigener blev oprindeligt udvalgt som modelproteiner til at blive vist på sporeoverfladen: i) det ikke-toksiske 459 aminosyre C-terminale fragment af tetanustoksin (TTFC), et velkarakteriseret og stærkt immunogent 51.8 kDa peptid , der er kodet af tetC-genet fra Clostridium tetani, og ii) den 103 aminosyre B-underenhed af det varmelabile toksin fra enterotoksiske stammer af Escherichia coli (LTB), et 12 kDa peptid, der er kodet af eltB-genet .

CotB som bærerprotein

Som andre kappekomponenter er CotB blevet associeret til det ydre kappelag på grundlag af genetiske beviser, og først for nylig har en immunocytofluorimetrisk analyse udført på intakte sporer vist, at CotB er tilgængelig for CotB-specifikke antistoffer, og at den derfor højst sandsynligt er eksponeret på sporeoverfladen .

Det strukturelle CotB-gen, cotB, er under dobbelt transkriptionskontrol af σK og det DNA-bindende protein GerE. Som følge heraf transskriberes cotB kun i modercellekompartmentet i den sporulerende celle . Når CotB er syntetiseret i modercellens cytoplasma, samles det omkring den dannende spore på en måde, der på en eller anden måde er afhængig af CotE, CotG og CotH. Derfor gennemgår CotB og det heterologe protein, der eventuelt fusioneres med det, ikke et translokationstrin til cellevæggen, som er typisk for display-systemer i andre bakterier.

CotB har en stærkt hydrofil C-terminal halvdel, der er dannet af tre 27 aminosyre-repeats, der er rige på serin-, lysin- og glutaminrester. Serinrester udgør over 50 % af den C-terminale halvdel af CotB. Lysinresterne i CotB-repeterne er blevet foreslået som værende steder for intra- eller intermolekylær tværbinding i lighed med bindevævsproteinerne kollagen og elastin . CotB-proteinet har en afledt molekylmasse på 46 kDa, men migrerer på SDS-PAGE som et polypeptid på 59 kDa. For nylig er uoverensstemmelsen mellem målt og afledt molekylvægt blevet forklaret ved at vise, at CotB oprindeligt syntetiseres som en 46 kDa art og omdannes til en 59 kDa homodimer , der bevarer både de N- og C-terminale ender, der forudsiges fra cotB-nukleotidsekvensen.

Strategien til at opnå rekombinant B. subtilis-sporer, der udtrykker CotB-TTFC eller CotB-LTB på deres overflade, var baseret på (i) brug af cotB-genet og dets promotor til konstruktion af translationelle fusioner og (ii) kromosomal integration af cotB-tetC- og cotB-eltB-genfusionerne i den kodende sekvens af det ikke-essentielle gen amyE (figur 3A) . Placering af fusionsproteinerne under cotB-transkriptionelle og translationelle signaler sikrede korrekt timing af ekspressionen under sporulation, mens kromosomal integration garanterede konstruktens genetiske stabilitet. På grund af manglen på oplysninger om CotB-kappens samling og om kravene til forankringsmotiver blev de første forsøg udført ved at placere passagerproteinet på C-terminal, N-terminal eller i midten af CotB (figur 3B).

Spore-surface display system i B. subtilis . (A) Skematisk oversigt over integrationen af genfusioner på kromosomet. Røde søjler repræsenterer genfusionen, grå og grønne søjler repræsenterer henholdsvis det ikke-essentielle amyE-gen i B. subtilis, der anvendes som integrationssted, og chloramphenicol acetyltransferase (cat)-genet, der anvendes som selekterbar markør. (B) Skematisk fremstilling af fusionsproteiner ved hjælp af enten fuld længde CotB (380 aminosyrer) eller CotBΔ105 (275 aminosyrer) eller CotC (66 aminosyrer) som bæreproteiner (alle i blå farve). De tre 27-aminosyre gentagelser af den fulde længde CotB og den del af dem, der er tilbage i CotBΔ105, er i sort. Lilla søjler repræsenterer den heterologe del af fusionerne (TTFC eller LTB).

Når TTFC og LTB blev fusioneret til den C-terminale ende af CotB, lykkedes det ikke for de chimære proteiner at samle sig korrekt på sporeoverfladen (Isticato og Ricca, upubliceret). Sådanne indledende fiaskoer blev tilskrevet en potentiel ustabilitet af konstruktionerne, enten på DNA-niveau (repetitive DNA-sekvenser) eller på proteinniveau. For at omgå sådanne problemer blev TTFC og LTB fusioneret til den C-terminale ende af en CotB-form, der er slettet af de tre 27 aminosyre-repeats, CotBΔ105-TTFC (fig. 3A). I modsætning til den fulde længdeversion blev det kimære CotBΔ105-TTFC-protein korrekt samlet og eksponeret på sporeoverfladen . En kvantitativ dot blot viste, at hver rekombinant spore eksponerede en mængde CotBΔ105-TTFC-fusionsprotein svarende til 0,00022 pg, hvilket gør det muligt at konkludere, at der er 1,5 × 103 kimære molekyler til stede på overfladen af hver rekombinant spore .

I modsætning til CotBΔ105-TTFC var CotBΔ105-LTB ikke korrekt sammensat. Den stamme, der udtrykker denne kimære, viste nedsat sporulations- og spiringseffektivitet, og dens sporer var ikke resistente over for lysozym. Disse observationer, sammen med SDS-PAGE-analysen af de frigjorte kappeproteiner, tyder på, at tilstedeværelsen af CotBΔ105-LTB i høj grad ændrede sporernes kappelag. En in-silico-analyse viste en vis homologi mellem det chimære produkt (i fusionsregionen) og LytF, en cellevægsassocieret endopeptidase, der produceres af B. subtilis under vegetativ vækst, hvilket giver mulighed for, at det chimære produkt kunne forstyrre en korrekt pelsdannelse ved at nedbryde nogle pelsbestanddele (Mauriello og Ricca, data ikke vist).

Ud over den ovenfor beskrevne C-terminale endefusion er modelpassagerproteinet TTFC også blevet fusioneret ved N-terminalen og i midten af CotB (Fig. 3B). I begge tilfælde blev CotBΔ105-formen af CotB anvendt for at undgå de problemer, der opstod med den C-terminale fusion (se ovenfor). Både den N-terminale og sandwich-fusionen gav kimære produkter, som var korrekt samlet i kappestrukturen både kvalitativt og kvantitativt set . I det mindste for CotB’s vedkommende var det derefter muligt at konkludere, at hvor passagerproteinet er udsat, påvirker det ikke visningen på sporeoverfladen.

CotC som bærerprotein

CotC er en 12 kDa, alkaliopløselig komponent i B. subtilis’ sporekappe, der tidligere er identificeret ved hjælp af omvendt genetik og derefter associeret til det ydre kappelag på grundlag af genetisk dokumentation . CotC blev oprindeligt betragtet som en bærerkandidat på grund af dens relative hyppighed i pelsen (figur 1B). Sammen med CotG og CotD udgør CotC ca. 50 % af de samlede solubiliserede kappeproteiner. Sådanne relativt store mængder kunne gøre det muligt at samle et betydeligt antal CotC-baserede kimærer på pelsen og dermed sikre en effektiv heterolog visning. Ekspressionen af CotC-genet er under kontrol af den modercellespecifikke σ-faktor σK og af transkriptionelle regulatorer GerE og SpoIIID. Som det er tilfældet med CotB, transskriberes CotC også i modercellen, og dets samling på pelsen kræver ikke membrantranslokation. Det primære produkt af cotC-genet er et polypeptid på 66 aminosyrer, der er ekstremt rigt på tyrosin- (30,3 %) og lysin- (28,8 %) rester . Det blev imidlertid for nylig vist, at CotC er samlet i mindst fire forskellige proteinformer, der varierer i størrelse mellem 12 og 30 kDa . To af disse, der har en molekylmasse på 12 og 21 kDa og sandsynligvis svarer til henholdsvis en monomer og en homodimer form af CotC, samles på den dannende spore lige efter deres syntese otte timer efter sporulationens begyndelse. De to andre former, 12,5 og 30 kDa, er sandsynligvis produkter af posttranslationelle modifikationer af de to andre former, der forekommer direkte på pelsoverfladen under modningen af sporerne.

For CotC’s vedkommende er der hidtil kun konstrueret C-terminale fusioner (figur 3B). Både CotC-TTFC- og CotC-LTB-genfusioner blev opnået ved at klonere tetC eller eltB i frame med det sidste cotC-kodon under transkriptionel og translationel kontrol af cotC-promotorområdet. Genfusionen blev derefter integreret i B. subtilis-kromosomet ved amyE-lokusset ved dobbelt cross-over-rekombination (figur 3A). Begge disse to chimære proteiner blev samlet på kappen af rekombinante sporer uden større effekt på sporernes struktur og/eller funktion, da de viste sig at være identiske med vildtypesporer med hensyn til sporulations- og spiringseffektivitet og resistensegenskaber. Western Blot, cytofluorimetrisk analyse og, for CotC-TTFC, immunofluorescensmikroskopi (figur 4) viste, at begge CotC-baserede kimærer blev vist på overfladen af de rekombinante sporer. En kvantitativ bestemmelse af rekombinante proteiner, der blev eksponeret på B. subtilis-sporer, viste, at ca. 9,7 × 102 og 2,7 × 103 molekyler af henholdsvis CotC-TTFC og CotC-LTB blev ekstraheret fra hver spore.

Detektion af tilstedeværelsen af CotC-LTB og CotC-TTFC ved hjælp af immunofluorescensmikroskopi. Sporulation af B. subtilis-stammer blev induceret ved resuspensionsmetoden, og prøver blev udtaget 6 timer efter sporulationsbegyndelsen og analyseret ved immunofluorescensmikroskopi som tidligere beskrevet . Prøverne blev mærket med mus anti-LTB-antistof efterfulgt af anti-mus IgG-TRITC-konjugat (rød fluorescein, panel A & B), eller kanin anti-TTFC-antistof efterfulgt af anti-kanin-IgG-FITC-konjugat (grøn fluorescein, panel C & D). Panel A & C, wild type sporer; Panel B, isogene sporer, der udtrykker CotC-LTB); Panel D, isogene sporer, der udtrykker CotC-TTFC.

Selv om CotC forekommer mere rigeligt end CotB i pelsen, eksponeres sammenlignelige mængder af heterologe proteiner af de CotC-baserede og CotBΔ105-baserede systemer. Dette resultat var noget uventet, da CotC synes at være meget mere rigeligt forekommende end CotB i pelsen. En mulig forklaring stammer fra det nylige fund, at den C-terminale ende af CotC ikke kun er afgørende for interaktion med andre CotC-molekyler, men også med andre coat-komponenter (Isticato og Ricca, manuskript under forberedelse) og viser derfor, at brugen af CotC som bærer stadig skal optimeres.

Stabilitet af spore-displayede proteiner

En af de vigtigste grunde til at foreslå brugen af bakteriesporen som et gunstigt display-system er dens veldokumenterede stabilitet. Sporer kan simpelthen opbevares ved stuetemperatur i lang tid uden at deres modstandsdygtighed og stabilitetsegenskaber forringes. Dette ville være en yderst nyttig egenskab for en lang række bioteknologiske anvendelser. Hvis passagerproteinet f.eks. er et antigen, kunne den rekombinante spore blive en ideel varmestabil oral vaccine til brug i udviklingslandene, hvor varmestabilitet er af største betydning på grund af dårlig distribution og opbevaring.

Men mens sporernes stabilitet er veldokumenteret, er stabiliteten af heterologe proteiner, der er eksponeret på sporens overflade, først for nylig blevet undersøgt. Sporer, der udtrykker CotBΔ105-TTFC (se ovenfor), og forældresporer blev opbevaret ved -80°C, -20°C, +4°C og ved stuetemperatur og undersøgt ved forskellige opbevaringstider på op til 12 uger. I alle tilfælde viste mængden af heterologt protein, der var til stede på overfladen af rekombinante sporer, sig at være identisk mellem frisk fremstillede sporer og dem, der blev opbevaret i op til 12 uger (fig. 5). Disse resultater, der viser, at heterologe proteiner kan eksponeres stabilt på overfladen af rekombinante sporer, bekræfter det spore-baserede system som en meget lovende metode til fremvisning, der kan overvinde nogle af ulemperne ved andre systemer, og som kan finde anvendelse inden for en række forskellige bioteknologiske områder.

Dot blot-analyse af proteiner ekstraheret fra wild-type sporer og fra sporer, der eksponerer CotBΔ 105 -TTFC-chimæren. Frisk oprensede sporer, der udtrykker CotBΔ105-TTFC-chimæren (t0) eller efter 4, 8 eller 12 ugers (t4, t8 og t12) opbevaring ved stuetemperatur, blev undersøgt ved dot blotting af ekstraherede proteiner fra sporernes kappe. Koncentrationerne af renset TTFC (i nanogram) og af kappeproteiner (i mikrogram) er angivet. Proteinerne blev indlæst og reageret med monoklonale anti-TTFC-antistoffer (Boeringher) og derefter med fosfatase-konjugerede sekundære antistoffer. Der blev opnået signaler af samme intensitet med frisk oprensede sporer og med sporer, der blev opbevaret ved stuetemperatur i op til 12 uger.

Proof of Principle for Oral Vaccination Using Tetanus as a Model Disease

Sporer, der udtrykker CotBΔ105-TTFC, er blevet anvendt til immunisering af mus ad oral vej . Serum IgG og fækalt sIgA viste tydelig serokonversion til TTFC. Doseringsskemaet anvendte tre sæt af tre doser (1,67 × 1010) over 5 uger og var baseret på skemaer, der var optimeret til oral immunisering . Titerne af TTFC-specifik IgG efter 33 dage (>103) tyder på, at de var på et beskyttende niveau, og mus, der blev udfordret med tetanustoksin svarende til 10 LD50, var fuldt beskyttet. Ud af otte mus, der blev udfordret med en dosis på 20 LD50, overlevede syv mus, hvilket tyder på, at dette var tærsklen for beskyttelse. Der blev foretaget en lignende undersøgelse ved hjælp af nasal immunisering med CotB-TTFC-sporer, men med en lavere dosis og tre immuniseringer . Her var de TTFC-specifikke IgG-svar lavere, men der var stadig serokonversion. Disse undersøgelser viser, at manipulerede sporer, der udtrykker et heterologt antigen, kan anvendes til beskyttende immunisering. Selv om slimhinderesponser ikke er vigtige for beskyttelse mod Clostridium tetani (et systemisk patogen), er de desuden tydeligvis vigtige for slimhindepatogener. Der vil være behov for yderligere undersøgelser for at optimere doseringsregimer (færre doser og færre sporer), men disse banebrydende undersøgelser har banet vejen for udvikling af vacciner mod specifikke slimhindepatogener. Selv om disse undersøgelser er opmuntrende og viser humorale reaktioner, er der endnu ikke noget klart bevis for, at der er tale om cellulære reaktioner. Det er imidlertid blevet påvist, at sporer spredes til GALT og findes i Peyers Patches (PP) og mesenteriske lymfeknuder . Sporenes lille størrelse (1 μm) ville gøre det muligt for den at blive optaget af M-celler og transporteret til PP, hvor den kan interagere med antigenpræsenterende celler. De første undersøgelser har vist, at sporerne kan spire og persistere i kort tid i tarmmakrofager samt fremkalde Th 1 cytokiner in vivo såsom IFN-γ .