Kromatins tilgængelighed og arkitektur

Figur 3: Teknikker til kromosomkonformation. Forskellige trin i 3C, 4C, 5C, ChIA-PET og Hi-C.

Chromatin conformation capture (3C)

3C anvender formaldehyd-krydsbinding til at fastlåse den tredimensionelle kromatinstruktur på plads efterfulgt af restriktionsenzymfordøjelse. Udskårne DNA-fragmenter analyseres derefter ved qPCR og sekventering for at identificere, hvor fjerntliggende DNA-regioner er forbundet. Denne metode til analyse af 3D-kromatinstruktur og interaktioner in vivo blev først udviklet i 2002 (Dekker et al., 2002), og er siden blevet grundlaget for et væld af beslægtede teknikker, der er blevet udviklet for at opnå større skala, gennemløb eller specificitet.

Circularized chromosome conformation capture (4C)

4C muliggør identifikation af tidligere ukendte DNA-regioner, der interagerer med et locus af interesse, hvilket gør 4C ideel til at opdage nye interaktioner inden for en specifik region (Dekker et al, 2006).

4C nyttige tips:

• Vælg de rigtige restriktionsenzymer. Hyppigere cutters (dvs. fire bp genkendelsessteder) er bedre til lokale interaktioner mellem regionen af interesse og nærliggende sekvenser på samme kromosom (van der Werken et al., 2012).
• Optimer krydsforbindelsen. Lavere formaldehydkoncentrationer fremmer uønskede region-of-interest-selvbindinger, men forhindrer også DNA-“hårboller”, der hindrer restriktionsenzymskæring. Høje formaldehydkoncentrationer mindsker selvligeringshændelser, men øger hårboller. Der bør vælges en optimal formaldehydkoncentration for den specifikke eksperimentelle situation for at afbalancere disse overvejelser. 1% formaldehydbehandling i 10 min er et godt udgangspunkt for de fleste eksperimenter (van der Werken et al., 2012).

Carbon copy chromosome conformation capture (5C)

5C genererer et bibliotek af eventuelle ligationsprodukter fra DNA-regioner, der associerer sig med mållokierne, som derefter analyseres ved NGS. 5C er ideel, når der er behov for store detaljer om alle interaktioner i en given region, f.eks. ved diagrammering af en detaljeret interaktionsmatrix for et bestemt kromosom. 5C er dog ikke virkelig genomdækkende, da hver 5C-primer skal designes individuelt, så den er bedst egnet til en specifik region (Dotsie og Dekker, 2007).

5C nyttige tips:

• Vælg det rigtige restriktionsenzym. Det er vigtigt at vælge et enzym, der fungerer effektivt under dine specifikke forsøgsbetingelser. For eksempel anbefales BamHI ikke til de fleste eksperimenter på grund af ineffektivitet under 3C-betingelser (Dotsie et al., 2007).
• Optimer primerdesign. 5C anvender to primere: en fremadrettet 5C-præmmer, der binder opstrøms for ligeringsstedet, og en omvendt primer, der binder umiddelbart nedstrøms. Primerlængden bør justeres, så annealingstemperaturen er ca. 65 °C, så primerne kan annealere nøjagtigt med deres restriktionsfragmenter. Sørg for, at 5C-primere syntetiseres med et fosfat i 5′-enden med henblik på ligation.
• Brug en kontroltemplate. Dette vil kontrollere for forskelle i primereffektivitet. Det anbefales at anvende et kontrolbibliotek, der er konstrueret fra hele den genomiske region, der undersøges. Hvis dette bibliotek ikke konstrueres, skal forskerne være opmærksomme på, at interaktionsfrekvenserne vil være mindre præcise.

Chromatin interaktionsanalyse ved parvis end tag-sekventering (ChIA-PET)

ChIA-PET tager aspekter af ChIP og 3C med henblik på at analysere samspillet mellem fjerntliggende DNA-regioner gennem et bestemt protein.

ChIA-PET anvendes bedst til opdagelseseksperimenter, der involverer et protein af interesse og ukendte DNA-bindingsmål. Transkriptionsfaktorbindingssteder undersøges f.eks. bedst med ChIA-PET, da denne teknik kræver, at DNA’et er bundet af transkriptionsfaktoren in vivo, for at interaktionen kan kaldes (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET nyttige tips:

• Overlap PET-tags for at reducere baggrund. Som de fleste 3C-teknologier er baggrundsstøj en teknisk udfordring. Især i ChIA-PET kan støj gøre det vanskeligt at finde langtrækkende interaktioner med det pågældende locus. Et nyttigt tip til at overvinde dette er at kræve, at PET’er skal overlappe i begge ender af regionen for at være en langtrækkende interaktion.

ChIP-loop

ChIP-loop er en blanding af ChIP og 3C, der anvender antistoffer målrettet mod proteiner, der mistænkes for at binde en DNA-region af interesse. ChIP-loop er ideel til at finde ud af, om to kendte DNA-regioner interagerer via et protein af interesse. ChIP-loop er også velegnet til bekræftelse af formodede interaktioner, men ikke til opdagelse af nye interaktioner (Horike et al., 2005).

ChIP-loop nyttige tips:

• Undgå ikke-native loops. Det største problem, som man støder på med ChIP-loop, er dannelsen af ikke-native loops, der dannes under DNA-koncentrationen, inden ligeringen finder sted. En enkel måde at undgå dette på er at vælge en protokol, der udfører udfældningen efter ligeringstrinnet (Simons et al., 2007).
• Validér ChIP-loop-interaktioner. En anden udfordring i ChIP-loop kan være nøjagtig kvantificering af ligationsprodukter. 3C-teknologier, især ChIP-loop, fanger ofte tilfældige interaktioner. For at bekæmpe dette bør man overveje at udføre et ChIP-eksperiment parallelt og bruge det til at validere ChIP-loop-interaktionerne. Hvis en DNA-protein-DNA-interaktion identificeret af ChIP-loop faktisk er reel, bør begge DNA-protein-interaktioner også fremgå af ChIP-dataene (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C forstærker ligationsprodukter fra hele genomet og vurderer deres hyppighed ved højhastigheds-sekventering. Hi-C er et godt valg, når der kræves bred dækning af hele genomet, og opløsningen ikke er af stor betydning, f.eks. ved kortlægning af genomdækkende ændringer i kromosomstrukturen i tumorceller (Lieberman-Aiden et al., 2009).

Hi-C nyttige tips:

• Optimering af biblioteksamplifikation. Hi-C-biblioteksamplifikation skal generere tilstrækkeligt produkt til analyse, samtidig med at PCR-artefakter undgås. For at gøre dette bør PCR-cyklusantallet optimeres (i intervallet 9-15 cyklusser). Hvis der ikke kan produceres tilstrækkeligt produkt (50 ng DNA), bør flere PCR-reaktioner samles i stedet for at øge cyklusantallet; fem reaktioner er normalt tilstrækkelige (Belton et al., 2012).
• Balancér læselængder. Som med ethvert sekvenseksperiment er læsninger af høj kvalitet altafgørende. Læselængden skal være optimal for at balancere behovet for lange læsninger for at kortlægge interaktioner, men ikke for lange, så de passerer gennem ligationsforbindelsen ind i partnerfragmentet. Derfor er læsninger på 50 bp optimale i de fleste tilfælde (Belton et al., 2012).
• Vælg en passende bin-størrelse. Dette er afgørende for dataanalysen. Bin-størrelsen bør være omvendt proportional med antallet af forventede interaktioner i et område. Brug mindre bin’er til hyppigere intrakromosomale interaktioner og større bin’er til mindre hyppige interkromosomale interaktioner (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C anvender en kombination af 3C- og oligonukleotidindfangningsteknologi (OCT) sammen med sekventering med højt gennemløb til at undersøge hundredvis af loci på én gang. Capture-C er ideel, når der er behov for både høj opløsning og genomisk skala. For eksempel ved at analysere den funktionelle effekt af hver sygdomsassocieret SNP i genomet på den lokale kromatinstruktur (Hughes et al., 2014).

Capture-C nyttige tips:

• Vælg omhyggeligt probepositioner. Det er bedst at placere prober tæt på restriktionsenzymstederne, endda overlappende, når det er muligt (Hughes et al., 2014).
• Hold bibliotekerne komplekse. Opretholdelse af bibliotekskompleksitet er den højeste prioritet. Et komplekst bibliotek betyder flere interaktioner af høj kvalitet i output. Derfor bør alt, der kan mindske bibliotekskompleksiteten, undgås, f.eks. en Hi-C biotin capture (Hughes et al., 2014).
• Hold øje med falsk interaktion i duplikerede regioner. Kortlægningsprocessen kan stimulere stærke interaktioner mellem disse regioner (f.eks. pseudogener), som i virkeligheden er artefakter (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y og Dekker J (2012). Hi-C: en omfattende teknik til registrering af genomers konformation. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M og Kleckner N (2002). Indfangning af kromosomkonformation. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). De tre “C’er” i indfangning af kromosomkonformation: kontrol, kontrol, kontrol, kontrol. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J og Dekker J (2007). Kortlægning af netværk af fysiske interaktioner mellem genomiske elementer ved hjælp af 5C-teknologi. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y og Dekker J (2007). Chromosomkonformitetsindfangning kulstofkopiteknologi. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF og Kohwi-Shigematsu T (2005). Tab af silent-chromatin looping og nedsat imprinting af DLX5 ved Rett syndrom. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). Et østrogenreceptor-alpha-bundet humant kromatininteraktom. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Omfattende kortlægning af langtrækkende interaktioner afslører foldningsprincipper for det menneskelige genom. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (august 2014). E-mailinterview.

Hughes JR, et al. (2014). Analyse af hundredvis af cis-reguleringslandskaber med høj opløsning i et enkelt højhastighedsforsøg. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J og de Laat W (2007). En evaluering af 3C-baserede metoder til at opfange DNA-interaktioner. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E og de Laat W (2012). 4C-teknologi: protokoller og dataanalyse. Methods Enzymol, 513, 89-112