ISH: in situ hybridiseringsprotokol

Opbevaring af prøver

RNA-konservering
Konservering af RNA er vanskelig på grund af tilstedeværelsen af RNase-enzym. Dette enzym findes på glasvarer, i reagenser og på operatører og deres tøj. RNase ødelægger hurtigt alt RNA i cellen eller selve RNA-sonden, så brugerne skal sikre, at de anvender sterile teknikker, handsker og opløsninger for at forhindre RNase-kontaminering af sonden eller vævs-RNA.

Generel opbevaring af prøver ved brug af frosne snit
For at opnå de bedste resultater på ældre objektglas, må objektglassene ikke opbevares tørt ved stuetemperatur. Opbevares i stedet i 100 % ethanol ved -20 °C eller i en plastboks dækket af saranfolie ved -20 °C eller -80 °C. En sådan opbevaring bevarer objektglas i flere år.

Valg af sonde

RNA-sonder

RNA-sonder bør være 250-1.500 baser lange; sonder på ca. 800 baser lange udviser den højeste følsomhed og specificitet. Transkriptionsskabeloner bør muliggøre transkription af både probe-RNA’er (antisense-streng) og negative kontrol-RNA’er (sense-streng). Dette opnås ved at klone i en vektor med modsatrettede promotorer. Cirkulære skabeloner skal lineariseres, før der laves en sonde, selv om PCR-skabeloner også kan anvendes.

DNA-sonder

DNA-sonder giver høj følsomhed ved in situ-hybridisering. De hybridiserer ikke så stærkt til mRNA-målmolekyler sammenlignet med RNA-sonder, så formaldehyd bør ikke anvendes i vaskningerne efter hybridiseringen.

Sondernes specificitet er vigtig. Hvis den nøjagtige nukleotidsekvens af mRNA’et eller DNA’et i cellen er kendt, kan der designes en præcis komplementær probe. Hvis >5% af baseparrene ikke er komplementære, vil sonden kun hybrideres løst til målsekvensen. Det betyder, at sonden er mere tilbøjelig til at blive vasket væk under vaske- og detektionstrinene og måske ikke bliver korrekt detekteret.

Digoxigenin (DIG)-mærket RNA-sonde in situ hybridiseringsprotokol

Denne protokol beskriver brugen af DIG-mærkede enkeltstrengede RNA-sonder til påvisning af ekspression af genet af interesse i paraffinindlejrede snit.

1) Deparaffinisering

For frosne snit startes ved trin 2. Hvis der anvendes formaldehydfikserede paraffinindlejrede sektioner, fortsættes med dette trin.

Hvor der fortsættes, skal objektglassene deparaffiniseres og rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffin kan medføre dårlig farvning af snittet.

Placér objektglassene i et stativ, og udfør følgende vaskninger:

• Xylen: 2×3 min
• Xylen 1:1 med 100 % ethanol: 3 min
• 100 % ethanol: 2×3 min
• 95 % ethanol: 3 min
• 70 % ethanol: 3 min
• 50 % ethanol: 3 min
• Skyl efter med koldt vandhanevand

Opbevar objektglassene i vandhanevand indtil antigenudtagning. Fra dette tidspunkt må objektglassene ikke tørre, da dette vil medføre uspecifik antistofbinding og høj baggrundsfarvning.

2) Antigenretrieval

Digestér med 20 µg/mL proteinase K i forvarmet 50 mM Tris i 10-20 min ved 37 °C. Inkubationstid og proteinase K-koncentration kan kræve optimering.

Vi anbefaler at prøve et proteinase K-titreringsforsøg for at bestemme de optimale betingelser. Utilstrækkelig fordøjelse vil reducere hybridiseringssignalet, og overfordøjelse vil resultere i dårlig vævsmorfologi, hvilket gør lokalisering af hybridiseringssignalet meget vanskelig. Den optimale proteinase K-koncentration vil variere afhængigt af vævstypen, fikseringens længde og vævets størrelse.

3) Skyl objektglassene 5x i destilleret vand.
4) Dyp objektglassene ned i iskold 20 % (v/v) eddikesyre i 20 sek. Dette permeabiliserer cellerne for at give adgang til sonden og antistoffet.
5) Dehydrer objektglassene ved at vaske dem i ca. 1 min. pr. vask i 70 % ethanol, 95 % ethanol og 100 % ethanol og derefter lufttørre.
6) Tilsæt 100 µL hybridiseringsopløsning til hvert objektglas.

Saltopløsning (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardt’s opløsning (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polyvinylpyrrolidin)
• 10 g bovin serumalbumin (BSA)
• 500 mL sterilt dH2O

7) Inkuberer objektglassene i 1 time i et befugtet hybridiseringskammer ved den ønskede hybridiseringstemperatur. Typiske hybridiseringstemperaturer ligger mellem 55-62 °C.
8) Fortynd proberne i hybridiseringsopløsning i PCR-rør. Opvarm ved 95 °C i 2 min. i en PCR-blok for at denaturere RNA- eller DNA-sonden. Afkøl straks på is for at forhindre reannealing.
9) Aftap hybridiseringsopløsningen. Der tilsættes 50-100 μL fortyndet sonde pr. sektion, der dækker hele prøven. Inkuberes i det befugtede hybridiseringskammer ved 65 °C natten over. Dæk prøven med et dækglas for at forhindre fordampning.

I dette trin vil RNA-sonden hybridisere til det tilsvarende mRNA, eller DNA-sonden vil hybridisere til det tilsvarende cellulære DNA. Hybridiseringstemperaturen optimeres afhængigt af sekvensen af den anvendte sonde og af celle- eller vævstypen. Denne temperatur bør optimeres for hver analyseret vævstype.

Optimal hybridiseringstemperatur for prober afhænger af den procentvise andel af baser, der er til stede i målsekvensen. Koncentrationen af cytosin og guanin i sekvensen er vigtige faktorer.

10) Strenghedsvaskninger

Løsningsparametre som temperatur, salt- og detergentkoncentration kan manipuleres for at fjerne uspecifikke interaktioner.

For at fremstille 1 L 20x saltvandsnatriumcitrat (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g natriumcitrat
• 800 mL sterilt dH2O
• Justér til pH 5 ved hjælp af citronsyre, fyld op til 1 L og autoklaver

Vask 1

• 50% formamid i 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Vask overskydende sonde og hybridiseringsbuffer væk med højere temperaturer (op til 65°C) i korte perioder. Hvis dette sker for længe, kan det vaske for meget af den hybridiserede probe RNA/DNA væk.

Vask 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Dette trin fjerner uspecifik og/eller repetitiv DNA/RNA-hybridisering.

Følg disse retningslinjer for optimering af temperatur og saltkoncentration for stringensvaskninger:

• For meget korte DNA/RNA-sonder (0.5-3 kb) eller meget komplekse prober bør vasketemperaturen være lavere (op til 45 °C) og stringensen lavere (1-2x SSC).
• For single-locus eller store prober bør temperaturen ligge omkring 65 °C og stringensen være høj (under 0.5x SSC).
• Temperaturen og stringensen bør være højest for repetitive prober (f.eks. alfa-satellit-repeats).

11) Vask to gange i MABT (maleinsyrebuffer indeholdende Tween 20) i 30 min. ved stuetemperatur. MABT er blidere end PBS og er mere egnet til detektion af nukleinsyre.

For at fremstille 5x MABT stock

• 58 g maleinsyre
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 mL vand

Hæv pH-værdien til 7,5 ved at tilsætte Tris-base. Der vil være behov for ca. 100 g. Det endelige volumen bringes til 1 L.

12) Tør objektglassene.
13) Overfør til et fugtigt kammer, og tilsæt 200 µL blokeringspuder til hvert snit (MABT + 2 % BSA, mælk eller serum). Blokér i 1-2 timer ved stuetemperatur.
14) Aftap blokeringsbufferen. Der tilsættes anti-mærkningsantistof i den ønskede fortynding i blokeringspuder. Se antistoffets datablad for en anbefalet koncentration/fortynding. Inkubér i 1-2 timer ved stuetemperatur.
15) Vask objektglassene 5×10 min. med MABT ved stuetemperatur.
16) Vask objektglassene 2×10 min. hver ved stuetemperatur med præfarvningsbuffer (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) For fluorescensdetektion fortsættes til trin 18. For andre former for detektion returneres objektglassene til det befugtede kammer, og producentens anvisninger for farveudvikling følges.

18) Skyl objektglassene i destilleret vand.
19) Lufttørre objektglassene i 30 min. Vask i 100 % ethanol, og lufttør grundigt.
20) Monter med DePeX-monteringsopløsning.