Hvordan kan jeg vide, om antistoffet vil krydsreagere?

Krydsreaktivitet opstår, når et antistof, der er fremstillet mod et specifikt antigen, genkender to antigener, der har lignende strukturelle regioner.

Hvad er krydsreaktivitet?

Et antistof har en specifik aminosyresekvens (Fab-regionen), der dikterer dets affinitet for et specifikt antigen. Krydsreaktivitet mellem antigener opstår, når et antistof, der er fremstillet mod et specifikt antigen, har en konkurrerende høj affinitet over for et andet antigen. Dette er ofte tilfældet, når to antigener har lignende strukturelle regioner, som antistoffet genkender.

Krydsreaktivitet kan gøre resultaterne af et forsøg ugyldige og dermed påvirke den videnskabelige reproducerbarhed. Derfor er testning af et antistof for krydsreaktivitet med nært beslægtede proteiner et kritisk valideringseksperiment.

Hvordan kontrollerer jeg krydsreaktivitet?

Krydsreaktivitet er ikke altid en negativ egenskab. Den kan undertiden forbedre et antistofs anvendelighed. F.eks. giver et antistofs krydsreaktivitet for et mål på tværs af arter mulighed for at anvende det samme antistof i flere modelorganismer.

Krydsreaktivitet på tværs af arter forekommer ofte for humane antigenafledte antistoffer. Mange humane antistoffer i Proteintech-kataloget har betydelig krydsreaktivitet med de homologe proteiner i ikke-menneskelige modeller, f.eks. mus, rotte, abe eller zebrafisk.

Baseret på homologien af en proteinsekvens og publikationer, der anvender vores antistoffer i ikke-menneskelige organismer, kan mange af Proteintechs antistoffer anvendes ikke kun til menneskelige prøver, men også til en række forskellige organismer. Homologien kan undersøges ved hjælp af en parvis sekvenstilpasning af immunogenet og målantigenet via NCBI-BLAST-webstedet, og yderligere oplysninger kan kontrolleres på webstedet UniProt, som er en universel proteinressource.

Hvad er det “rigtige tal” for homologi til at forudsige krydsreaktivitet?

Baseret på vores erfaring forudses det, at hvis immunogenet og sekvensen af det potentielt krydsreaktive protein har 75 % sekvenshomologi, forudsiges det at krydsreagere. Hvis din prøve er ikke-menneskelig, anbefales en polyklonal, fordi der er en blanding af epitoper, der genkendes.

Krydsreagerer mit antistof med andre arter?

Det afhænger af omfanget af proteinsekvenslighed mellem immunogenet og den potentielle krydsreaktive proteinsekvens.

Hvordan undgås krydsreaktivitet i western blot

Hvis det er muligt, anbefales det at anvende det sekundære antistof, der er specifikt for det første anvendte antistof; hvis det primære antistof f.eks. er mus, skal det sekundære antistof være anti-mus IgG-HRP. Hvis det sekundære antistof er polyklonalt og genereret mod hele IgG-molekylet, er kaninantistof, der genkender det primære mus-AB, måske ikke det bedste valg på grund af genkendelsen af den fælles Kappa Light Chain-region.

Hvordan man undgår krydsreaktivitet under immunfarveforsøg

Krydsreaktivitet kan forekomme i immunfarveforsøg, hvor der anvendes vævsprøver; derfor er det almindeligt at anvende fragmenter snarere end hele IgG’er som primære immunoglobuliner (f.eks. når der arbejdes med museantistoffer på musevæv). For at sikre, at der ikke er nogen krydsreaktion, bør man desuden forsøge at anvende forskellige sekundære antistoffer, f.eks. 568 kanin-anti-geder med en 488 kanin-anti-mus, som er ret almindelige og lette at finde, når man foretager flere farvninger.

Hvad er krydsadsorption af sekundære antistoffer og krydsreaktivitet?

Krydsadsorberede sekundære antistoffer er de polyklonale antistoffer, der fremstilles med et ekstra rensningstrin for at filtrere medlemmer, der binder til off-target arter af immunoglobulin (IgG), fra. Denne proces kan mindske krydsreaktiviteten mellem arter og øge specificiteten. Afhængigt af forsøgsopsætningen findes der sekundære antistofsorter med krydsadsorbering og med høj krydsadsorbering.

1. Polyklonale vs. monoklonale antistoffer

2. Udvælgelse af sekundære antistoffer

3. Protein- eller peptidantigen? Fordele og ulemper