Fysisk-kemiske egenskaber af lecithinbaserede nanoemulsioner fremstillet ved spontan emulgering eller højtrykshomogenisering

ARTIGO

Fysisk-kemiske egenskaber af lecithinbaserede nanoemulsioner fremstillet ved spontan emulgering eller højtrykshomogenisering

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Nanoemulsioner bestående af en mellemkædet triglyceridoliekerne stabiliseret med raps- eller solsikke-lecithiner blev fremstillet ved spontan emulgering og højtrykshomogenisering. Disse nanoemulsioner er sammenlignet med formuleringer, der er stabiliseret med æglecithin. Nanoemulsioner fremstillet ved højtrykshomogenisering har en større dråbestørrelse (230-440 nm) sammenlignet med dem, der er fremstillet ved spontan emulgering (190-310 nm). Emulsionernes zetapotentiale var negative og under -25 mV. Zeta-potentialeinversionen fandt sted mellem pH 3,0 og 4,0. Resultaterne viser, at det er muligt at fremstille lipidemulsioner med raps- eller solsikke-lecithiner ved spontan emulgering og højtrykshomogenisering.

Nøgleord: nanoemulsion; lecithin; parenteral; højtrykshomogenisering; spontan emulgering.

INDLEDNING

En parenteral ernæringsregime består grundlæggende af makronæringsstoffer (aminosyrer, kulhydrater og lipider) og mikronæringsstoffer (vitaminer, elektrolytter og mikroelementer) efter recept fra en læge, afhængigt af patientens tilstand, alder og vægt1 . De lipidmakronæringsstoffer, der administreres som emulsioner, er energidonorer, leverandører af essentielle fedtsyrer og bærere af fedtopløselige vitaminer. De fedtsyrer, der er indeholdt i disse formuleringer, har stor metabolisk betydning, da de er cellemembrankomponenter og spiller specifikke roller i hormonsignalering og -transport. Desuden er de forløbere for prostaglandiner, leukotriener, thromboxaner og prostacykliner, som modulerer inflammatoriske processer, nyrefunktion og trombocytaggregation.2 En mangel på essentielle fedtsyrer hos for tidligt fødte børn under hjerneudviklingen resulterer i indlæringsproblemer og nedsat synsfunktion, som kan være irreversible, selv om der senere i udviklingen gives en tilstrækkelig fedtsyreholdig kost.2

Parenterale lipidemulsioner er heterogene systemer, der består af en olieagtig fase, som er homogent dispergeret i en vandig fase (dispergeringsmiddel) ved tilstedeværelse af en emulgator. Formuleringerne er kendetegnet ved en lille dråbestørrelse, normalt mellem 200 og 500 nm, på grund af risikoen for embolisme som følge af brugen af større partikler. Emulsionerne skal også have en fysiologisk forenelig pH (omkring 7), isotonicitet, lav viskositet og et højt zetapotentiale (i modul) for at forhindre forekomsten af instabilitetsfænomener.3

Lipidnanoemulsioner anvendes almindeligvis i totale parenterale ernæringsblandinger, kendt som 3-i-1-systemer, hvor alle makronæringsstoffer og mikronæringsstoffer tilsættes til en ethylvinylacetat (EVA)-pose. Disse blandinger er imidlertid udsat for en vis fysisk ustabilitet på grund af tilstedeværelsen af elektrolytter og andre komponenter, som kan udfælde eller interagere med emulsionsdråberne. Calcium- og fosfatudfældning er almindeligt beskrevet i litteraturen. Desuden kan divalente ioner (såsom calcium og magnesium) forstyrre emulsionens zeta-potentiale og fremkalde aggregering/flocculation af lipiddråberne efterfulgt af koalescens. Dette fænomen er meget alvorligt, fordi enhver dråbe med en diameter på over 5 µm, der kommer ind i blodbanen, kan forårsage en fedtemboli.4,5

De fysiske egenskaber og den deraf følgende stabilitet af lipidemulsioner er stærkt relateret til deres fremstillingsmetode og sammensætning.3,6 Produktionsmetoderne er forskellige og kan kræve mere end ét trin for at fremstille en emulsion med en reduceret dråbestørrelse. En højhastighedshomogenisator (Ultraturrax®) kan f.eks. først skabe en grov emulsion. Dråbestørrelsesreduktion kan derefter opnås ved højtrykshomogenisering, mikrofluidisering eller ultralydsbehandling.7-9 Blandt metoder, der ikke kræver forbehandling, er spontan emulgering, der primært anvendes i formuleringsundersøgelser og let kan udføres i laboratorieskala, fordi det ikke er nødvendigt at anvende sofistikeret udstyr.10

Tabel 1 viser sammensætningen af typiske kommercielt tilgængelige intravenøse lipidemulsioner. Ud over de beskrevne komponenter skal formuleringerne opfylde kravene til injicerbare produkter.11

Den olieagtige fase i parenterale emulsioner består af langkædede triglycerider (LCT), som kan kombineres med mellemkædede trigylcerider (MCT), som vist i tabel 1. LCT omfatter en lang række forskellige olier, såsom solsikkeolie, ricinusolie, olivenolie eller, mere almindeligt, sojabønneolie. Disse olier indeholder alle fedtsyrekæder, der er længere end 12 kulstofatomer. MCT fremstilles ved forestering af fedtsyrer fra kokosolie. De foretrukne emulgatorer til stabilisering af injektionsemulsioner er lecithiner, da de er biokompatible og bionedbrydelige. Lecithiner er naturlige blandinger af polære og neutrale fosfolipider, der er fremstillet af animalske eller vegetabilske kilder.12 Fosfolipidsammensætningen af lecithiner fra vegetabilske kilder kan variere på grund af udvinding, afgrøde og andre forarbejdningsbetingelser.13 De indeholder hovedsagelig amfotere fosfolipider, såsom fosfatidylcholin og fosfatidylethanolamin, men der kan også være negative fosfolipider til stede.

Kommercielt tilgængelige lipidemulsioner til parenteral ernæring består oftest af æggeblommelecitin eller, sjældent, sojalecitin (Solipid® E&S). På trods af de mange fordele ved fedttilskud er der rapporteret om negative kliniske virkninger i forbindelse med langtidstilskud på grund af metaboliske begrænsninger og immunreaktioner hos kritisk syge patienter.14,15 Der er rapporteret om bivirkninger ved parenterale lipidemulsioner, som er relateret til tilstedeværelsen af sojabønne- og æggeblommelecitiner.16-18 Interaktioner mellem lægemiddel- og fødevareallergi kan føre til en række bivirkninger, fra gastrointestinale forstyrrelser til anafylaksi.19

I denne sammenhæng fortsætter søgningen efter alternative råvarer for at finde hypoallergene erstatninger, der er mere sikre til parenteral administration til patienter. Dette arbejde prioriterer søgningen efter forskellige lecithiner med det formål at finde nye alternativer til lipidemulsioner beregnet til parenteral ernæring eller endog som lægemiddelbærere for at give de sikreste muligheder for patienter (især præmature spædbørn) med overfølsomhed over for æg- eller sojabønnebaserede emulgatorer. Vi forsøgte at udvikle parenterale lipidnanoemulsioner, der er stabiliseret med raps- eller solsikke-lecithiner, og sammenlignede disse med nanoemulsioner indeholdende æglecithin. Desuden sammenlignes fremstillingen ved spontan emulgering med højtrykshomogenisering, som almindeligvis anvendes til industriel fremstilling af parenterale lipidemulsioner.

MATERIALER OG METODER

Kemikalier og reagenser

MCT, sojaolie og æggeblomme (Lipoid E80®), raps (Lipoid R100®) og solsikke (Lipoid H100®) lecithiner blev indhentet fra Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Tyskland), som venligst donerede raps- og solsikke lecithinerne. Glycerol og ethanol blev fremstillet af henholdsvis Merck (Brasilien) og Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ultrarent vand blev fremstillet i et Milli-Q® apparat (Millipore, Billerica, USA).

Fremstilling af nanoemulsioner

Lipidemulsioner blev fremstillet i tre eksemplarer ved to metoder: spontan emulgering og højtrykshomogenisering. De formuleringer, der blev opnået ved spontan emulgering, blev fremstillet i henhold til en tidligere beskrevet procedure.10,20 Kort fortalt blev sojabønneolie blandet med MCT, lecithin og ethanol. Glycerol blev opløst i vand, hvortil den ethanoliske fase langsomt blev tilsat under moderat magnetisk omrøring i 30 min. Opløsningsmidlet blev derefter fjernet ved destillation under reduceret tryk i en roterende inddamper. De formuleringer, der blev fremstillet ved højtrykshomogenisering, blev fremstillet som tidligere beskrevet.21 For det første blev lecithin dispergeret i vand indeholdende glycerol og blandet under magnetisk omrøring ved 40 ºC, indtil der blev opnået en homogen vandig fase. Oliefasen bestod af sojabønneolie og MCT. Både olie- og vandfasen blev blandet under magnetisk omrøring (15 min. ved stuetemperatur) for at opnå en grov emulsion. De grove emulsioner blev derefter blandet ved 9500 rpm i 2 min. ved hjælp af en IKA® Ultra-Turrax T8-mixer (IKA® Works Inc., NC, USA) for at danne rå præemulsioner, som hver for sig blev underkastet højtrykshomogenisering (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canada) ved 750 bar (10 000 psi) i 10 cyklusser for at fremstille den endelige emulsion. pH-værdien af alle formuleringer blev justeret til 8,0 med 0,01 mol L-1 NaOH-opløsning. Emulsionerne blev opbevaret ved 4 ºC. Formuleringerne og deres bestanddele er angivet i tabel 2.

Fysisk-kemisk karakterisering af nanoemulsioner

Formuleringernes pH-værdier blev bestemt direkte i prøverne lige efter fremstillingen ved hjælp af et kalibreret potentiometer (Digimed, São Paulo, Brasilien) ved stuetemperatur. Den gennemsnitlige dråbestørrelse og polydispersitetsindekset blev målt ved hjælp af fotonkorrelationsspektroskopi (PCS), og zetapotentialet blev bestemt ved hjælp af elektroforesetisk mobilitet ved hjælp af en Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, UK) ved 25 ºC. Til disse målinger blev nanoemulsionerne fortyndet i 1 mmol L-1 NaCl-opløsning i pH-området fra 2,0 til 8,0 enheder. Viskositeten blev vurderet ved kapillærviskosimetri ved 25 ºC (viskosimeterkonstant, k = 0,0212) ved 25 ± 0,1 ºC. Den tid, det tager væsken at flyde fra det øverste til det nederste mærke i et kapillarrør, blev registreret i sekunder. Alle formuleringer blev analyseret i tre eksemplarer.

Morfologisk analyse

Den morfologiske undersøgelse blev udført ved transmissionselektronmikroskopi (TEM). En dråbe af nanoemulsionen blev anbragt på et kulstofbelagt kobbergitter (200 mesh), negativt farvet med en 2,0 % uranylacetatopløsning og efterladt til tørring i 24 timer før undersøgelsen. Der blev anvendt et JEM-1200 EXII-instrument (JEOL, Tokio, Japan), der arbejdede ved 80 kV.

RESULTATER OG DISKUSSION

I denne undersøgelse udvikler vi lipidemulsioner beregnet til parenteral ernæring eller lægemiddeltransport, der er stabiliseret med to lecithiner fremstillet af vegetabilske kilder (raps (R) og solsikke (S)) som alternativer til æggeblommelecithin (E), et traditionelt stabilisator til parenterale emulsioner. For at sammenligne de nye formuleringer med de traditionelle formuleringer blev alle andre emulsionskomponenter holdt på koncentrationer svarende til dem i de kommercielle lipidemulsionsprodukter. I dette arbejde sammenlignes også to forskellige produktionsmetoder: spontan emulgering og højtrykshomogenisering.

Tabel 3 viser de resulterende nanoemulsioners fysisk-kemiske egenskaber. De formuleringer, der er fremstillet ved spontan emulgering, har en gennemsnitlig dråbestørrelse på mellem 220 og 300 nm, som bestemt ved PCS. I teorien er dette et område med høj emulsionsstabilitet.11,22,23 Efterhånden som dråbestørrelsen reduceres, øges selvdiffusionshastigheden til et punkt, hvor meget små dråber kan forhindres i at skumme ved diffusionsblanding.7,23 Nanoemulsioner, der indeholder raps- eller solsikkelecithin, udviser en mindre gennemsnitlig dråbestørrelse sammenlignet med dem, der indeholder æggeblommelecithin. Lignende resultater er beskrevet for nanoemulsioner fremstillet efter samme metode, udelukkende bestående af MCT, som oliefase, og stabiliseret med 2 % (m/m) æglecithin.24 På baggrund af disse data kunne man konkludere, at en koncentration på 1,2 % ville være tilstrækkelig til at emulgere blandingen af sojabønneolie, MCT og vand. Selv om der blev opnået en lille dråbestørrelse og et lavt polydispersitetsindeks, forblev emulsionerne imidlertid ikke fysisk stabile i mere end en uge efter fremstillingen, hvorefter fasedeling (koalescens) kunne observeres visuelt. Koalescensprocessen er et irreversibelt ustabilitetsfænomen, idet oliedråberne mister deres grænseflader og smelter sammen til større dråber.25

Den kvalitative og kvantitative sammensætning af nanoemulsioner kan ud over typen af emulgator og emulgeringsmetoden have direkte indflydelse på dråbestørrelsen.7,23 Der blev derfor afprøvet en anden metode til fremstilling af nanoemulsioner. Højtrykshomogenisering er almindeligt anvendt i den farmaceutiske industri til fremstilling af sådanne formuleringer, dog i industriel skala. Blandt de forskellige metoder, der findes til emulgering, er denne metode at foretrække på grund af dens effektive opløsning af dråberne. Det er en højenergimetode, hvor størrelsesreduktion opnås ved at tvinge en grov emulsion under højt tryk gennem en homogeniseringsventil, hvorved dråbestørrelsen deformeres og reduceres26 . Spontan emulgering er en billig, nem og pålidelig metode, og den anvendes normalt i eksperimentelle undersøgelser i stedet for en højtrykshomogenisator, som er langt mere kompleks og dyr.

Som det fremgår af tabel 3, producerede højtrykshomogenisering større dråbestørrelser i nanoemulsioner med raps- (296 ± 18 nm) eller solsikke-lecithin (417 ± 25 nm) sammenlignet med den tidligere metode og i forhold til kontrolemulsionerne med æg-lecithin (243 ± 12 nm). Det skal dog understreges, at selv om højtrykshomogeniseringen var mindre effektiv med hensyn til opløsning af dråberne, gav den formuleringen en større stabilitet. I modsætning til de emulsioner, der er fremstillet ved spontan emulgering, var disse visuelt stabile i mindst 30 dage. Disse resultater bekræfter præparationsmetodens betydning for emulsionsstabiliteten.

Med tanke på intravenøs anvendelse kan størrelsesfordelingen af lipidemulsionens dråber være endnu vigtigere end den gennemsnitlige dråbestørrelse. En lille population af store oliedråber kan være tilstrækkelig til at forårsage en fedtemboli hos patienter.4,5 Dråbestørrelsesfordelingerne i de fremstillede formuleringer er vist i figur 1.

I figur 1 observeres to populationer i formuleringer bestående af rapslecithin (fremstillet ved spontan emulgering, figur 1C) og solsikke-lecithin (fremstillet enten ved spontan emulgering eller ved højtrykshomogenisering, figur 1E og 1F). Som følge heraf opnås et polydispersitetsindeks på over 0,20 for disse formuleringer.

Stabiliteten af emulsioner kan korreleres med sammensætningen og egenskaberne af deres grænsefladefilm (lecithin), da denne bestemmer formuleringernes zetapotentiale og repulsionen mellem dråberne, som er en af mekanismerne for emulsionsstabilisering.27 Lecithin er en heterogen blanding af fosfolipider; dets heterogenitet er yderst fordelagtig på grund af grænsefladefilmens flydende karakter sammenlignet med en ren fosfolipid.28 De vigtigste fosfolipider i lecithinblandinger er fosfatidylcholin og fosfatidylethanolamin, som er uladede ved fysiologisk pH (7,4). Mindre mængder af sure lipider, som f.eks. fosfatidylinositol, fosfatidylserin og fosfatidylglycerol, kan også være til stede. Disse lipider ioniseres ved pH 7,0 og fremkalder en negativ overfladeladning på emulsionsdråberne, hvilket bidrager til deres stabilitet. Ethvert tilsat stof, der forstyrrer denne ladning, vil sandsynligvis ændre systemets stabilitet.29 Selv om lecithin af parenteral kvalitet er stærkt renset, indeholder det stadig en lille mængde andre fosfolipider, som det fremgår af tabel 4, der beskriver sammensætningen af de tre lecithinråvarer, der er anvendt i denne undersøgelse.

Som det fremgår af tabel 3, observeres et mindre zetapotentiale (modulværdi) for nanoemulsioner sammensat af raps- eller solsikke-lecithin og fremstillet ved spontan emulgering. Der er imidlertid ikke observeret nogen forskelle i zeta-potentialerne for nanoemulsioner fremstillet ved højtrykshomogenisering. Disse resultater tyder på, at den vigtigste faktor, der påvirker zetapotentialet, er fremstillingsmetoden. Selv om vores gruppe har optimeret begge metoder, skal de eksperimentelle betingelser normalt justeres under hensyntagen til sammensætningen af formuleringerne. Parametre såsom antallet af cyklusser og tryk kan ændres for at opnå de ønskede fysisk-kemiske egenskaber i de endelige formuleringer.30,31

Zetapotentialet af nanoemulsioner afhænger også af emulgatorens ionisering. En reduktion af den resulterende ladning (i modul) fra 40 mV til mindre end 25 mV kan øge flokkulerings- og koaguleringshastigheden.32 Zetapotentialet og den gennemsnitlige dråbestørrelse af nanoemulsioner sammensat af forskellige lecithiner og fremstillet ved forskellige emulgeringsmetoder blev evalueret ved i pH-området fra 2,0 til 8,0. Resultaterne er præsenteret i figur 2.

Overfladeladningen af alle formuleringer falder til nul mellem pH 3,0 og 4,0, som tidligere observeret for Intralipid®, en æglecithin-stabiliseret triglyceridemulsion.25 Zeta-potentialet afhænger af pH, da H+ er en potentialdeterminerende ion på fosfolipidoverfladerne med en isoelektrisk pH på 3,1.33 En reduktion i pH resulterer i et reduceret (mindre negativt) zetapotentiale og en hurtigere flokkuleringshastighed.34 Den gennemsnitlige dråbestørrelse viser en lille stigning ved pH-værdien for inversion af zetapotentialet. Af figur 3 kan man konkludere, at pH-værdien i nanoemulsioner helst bør være højere end 7,0, da der opnås et plateau ved denne pH-værdi, hvor der observeres maksimal afstødning mellem oliedråberne.

Endeligt blev morfologien af oliedråberne i de nanoemulsioner, der er fremstillet ved højtrykshomogenisering, undersøgt ved TEM. Figur 3 afslører homogene og sfæriske partikler, hvilket viser, at emulsionsdråberne har en gennemsnitlig dråbestørrelse i nanometerområdet. Disse resultater bekræfter den tidligere analyse af dråbestørrelsen.

Nanoemulsioner er systemer med lav viskositet og Newtonsk adfærd. Vurdering af emulsionens viskositet er afgørende, da intravenøs indgift af emulsioner med høj viskositet kan være meget smertefuldt for patienten.23,32 Nanoemulsioner sammensat af forskellige lecithiner viser lignende viskositeter. Som forventet observeres der ingen sammenhæng mellem den gennemsnitlige dråbestørrelse og viskositeten af nanoemulsioner, da alle formuleringer kun indeholdt 10 % oliekerne.35 Derimod observeres der nogle forskelle i viskositet for formuleringer fremstillet ved de forskellige fremstillingsmetoder: spontan emulgering gav lidt mere viskose emulsioner.

Det er værd at nævne, at sammensætningerne af de nanoemulsioner, der er undersøgt i dette arbejde, er baseret på sammensætningerne af kommercielle nanoemulsioner med æglecithin som emulgeringsmiddel. Anvendelsen af en anden emulgator kan kræve en optimering af koncentrationen og/eller emulgeringsbetingelserne. Kommercielle injicerbare nanoemulsioner bestående af sojalecithin (Solipid®) kræver f.eks. en koncentration på 1,5 % af emulgatoren. Der anvendes undertiden yderligere coemulgatorer for at stabilisere emulsionerne og fremme mindre polydispersitet og mindre dråber. Anvendelsen heraf er imidlertid begrænset til lipidemulsioner som lægemiddelbærere, fordi små mængder af formuleringerne administreres til dette formål: koemulgatorer anvendes ikke ofte i emulsioner til parenteral ernæring på grund af de store mængder af disse formuleringer, der administreres, og sikkerhedsproblemer, især når det drejer sig om for tidligt fødte spædbørn. Natriumoleat anvendes almindeligvis til stabilisering af formuleringer af injicerbare lipidemulsioner36 , der fungerer som et anionisk overfladeaktivt stof og solubiliserende middel.27

KONKLUSIONER

Resultaterne viser, at det er muligt at fremstille injicerbare lipidemulsioner bestående af raps- eller solsikke-lecithiner ved spontan emulgering og højtrykshomogenisering som alternativer til traditionelle æg-lecithin-nanoemulsioner for patienter, der er følsomme over for ægderivater. Der bør gennemføres yderligere undersøgelser for at optimere emulsifikationsforholdene for at forbedre langtidsstabiliteten af formuleringerne.

AKNOTER

Forfatterne vil gerne takke det nationale råd for videnskabelig og teknologisk udvikling (CNPq) for finansiel støtte og Lipoid GmbH for de tilvejebragte materialer.

1. Waitzberg, D. L.; Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica, 1st ed., Atheneu: São Paulo, 2009.

2. Adolph, M.; Clin. Nutr. 2001,20,11.

3. Bruxel, F.; Laux, M.; Wild, L. B.; Fraga, M.; Koester, L. S.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2012,35,1827.

4. Antunes, M.; Guedes, J.; Arq. Bras. Med. 1994,68,303.

5. Trissel, L. A.; Gilbert, D. L.; Martinez, J. F.; Baker, M. B.; Walter, W. V.; Mirtallo, J. M.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1999,23,67.

6. Almeida, M. E.; Teixeira, H. F.; H. F.; Koester, L. S.; Lat. Am. J. Pharm. 2008,27,780-88.

7. Benita, S.; Levy, M. Y.; J. Pharm. Sci. 1993,82,1069.

8. Robin, O.; Blanchot, V.; Vuillemard, J. C.; Paquin, P.; Lait 1992,72,511.

9. Mbela, T. K. M. M. N.; Ludwig, A.; Landau, I.; Deharo, E.; Haemers, A.; Int. J. Pharm. 1994,110,89.

10. Bouchemal, K.; Briançon, S.; Perrier, E.; Fessi, H.; Int. J. Pharm. 2004,280,241.

11. Klang, S.; Benita, S. In Submicron emulsions in drug targeting and delivery; Benita, S., ed; Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 1998, chap. 5.

12. Szuhaj, B. F.; Sipos, E. F. In Food Emulsifiers: Chemistry, Technology, Functional Properties and Application; Charalambous, G., Doxastakis, G., eds.; Elsevier Science Publishers B. V.: Amsterdam, 1989, chap. 10.

13. Schneider, M. I Lecithiner: Sources, Manufacture, & Uses, American Oil Chemists’ Society: Illinois, 1989.

14. Szuhaj, B. F. I Bailey’s Industrial Oil and Fat Products; Shahidi, F., ed.; John Wiley and Sons: New Jersey, 2005, vol. 3, chap. 13.

15. Adan, D.; La Gamma, E. F.; Browne, L. E.; Crit. Care Clin. 1995,11,751.

16. Himaya, D. T.; Griggs, B.; Mittman, R. J.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1981,13,318.

17. Buchman, A. L.; Ament, M. E.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1991,15,345.

18. Kamath, K. R.; Berry A.; Cummins, G.; New Engl. J. Med. 1981,304,360.

19. Wiesner, A. M.; Romanelli, F.; Stratman, R. C.; Smith, K. M.; Orthopedics 2008,31,149.

20. Yu, W.; Tabosa Do Egito, E. S.; Barrat, G.; Fessi, J. P.; Devissaguet, J. P.; Puisieux, F.; Int. J. Pharm. 1993,89,139.

21. Floyd, A. G.; Pharm. Sci. technol. 1999,2,134.

22. Driscoll, D. F.; Pharm. Res. 2006,23,1959.

23. Constantinides, P. P.; Tustian, A.; Kessler, D. R.; Adv. Drug Deliver. Rev. 2004,56,1243.

24. Martini, E.; Carvalho, E.; Leão, F.; de Oliveira, M. C.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2007,30,930.

25. Washington, C.; Adv. Drug Deliver. Rev. 1996,20(2-3),131.

26. Walstra, P.; Smulders, P. E. A. In Modern Aspects of Emulsion Science; Binks, B. P., ed.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1998, kap. 12.

27. Lachman, L.; Liberman, H.; Kanig, L. J. Teoria e Prática na indústria farmacêutica; 3rd ed., Lea & Febiger: Philadelphia, 2001.

28. Lawrence, M. J.; Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996,1,826.

29. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,66,1.

30. Dias, D. O.; Colombo, M.; Kelmann, R. G.; Souza, T. P. D.; Bassani, V. L.; Teixeira, H. F.; Anal. Chim. Acta 2012,721,79.

31. Fraga, M.; Laux, M.; Zandoná, B.; Santos, G. R.; Giuberti, C. S.; de Oliveira, M. C.; J. Drug Delivery Sci. Technol. 2008,18,398.

32. Jumaa, M.; Müller, B. M.; Int. J. Pharm. 1998,163,81; Roland, I.; Piel, G.; Delattre, L.; Evrard, B.; Int. J. Pharm. 2003,263,85.

33. Davis, S. S.; Galloway, M.; J. Pharm. Pharmacol. 1981,33,88.

34. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,64,67.

35. Silvander, M.; Hellstrom, A.; Warnheim, T.; Claesson, P.; Int. J. Pharm. 2003,252,123.

36. Formariz, T. P.; Sarmento, V. H. V.; Silva-júnior, A. A.; Scarpra, M. V.; Santilli, C. V.; Oliveira, A. G.; Colloids Surf., B 2006,51,54.

Refået 03/02/2014; accepteret 17/04/2014; offentliggjort på nettet 15/07/2014