Enterokokker

2.4.3.3.2 Hydrolytiske aktiviteter af enterokokker

Enterokokokker er kendt for at producere tre typer enzymer, der bidrager til deres opportunistiske patogenicitet: hyaluronidase, gelatinase og serinprotease . Hyaluronidase, der er kodet af det kromosomale hyl-gen, nedbryder den vigtigste bestanddel af værtscellers ekstracellulære matrix, hyaluronsyre, hvilket letter vævsinvasionen og spredningen af toksiner .

Gelatinase, der er kodet af det kromosomale gelE-gen, er en zinkmetalloprotease, der er aktiv på gelatine, men også på kollagen, kasein, hæmoglobin, β-insulin og andre biologisk aktive peptider . Dette enzym bidrager også til processen med biofilmdannelse, hvilket kan lette vævskolonisering og persistens på infektionssteder , . Serinproteasen, der er kodet af genet sprE, som ligger opstrøms for gelE og er samtransskriberet med sidstnævnte, deltager også i patogenesen ved at nedbryde værtsvæv .

Enterokokker bidrager til udviklingen af ostesmag under modning på grund af deres proteolytiske og lipolytiske aktiviteter og deres evne til at producere flygtige eller langkædede fedtsyrer, diacetyl, acetoin og andre flygtige forbindelser . Ifølge , er E. faecium involveret i udviklingen af smag, aroma, farve og tekstur. Den bidrager derfor til den samlede sensoriske profil af visse oste. Disse egenskaber gør den også til en foretrukken flora i andre fermenterede produkter som f.eks. grøntsager og kød.

Mens mælkesyrebakteriernes proteolytiske aktiviteter er velbeskrevne i litteraturen om fermenterede produkter, er enterokokkerne mindre velkendte . De er ret lave i mejeriprodukter, undtagen for visse stammer af E. faecalis . Ifølge , afhænger niveauet af proteolytisk aktivitet inden for denne slægt af arten og af stammen inden for samme art. De bedst beskrevne proteaser er i stand til at hydrolytere kasein, men også β-laktoglobulin og α-laktalbumin . Mange undersøgelser viser, at oste fremstillet af mælk, der er podet med E. faecalis, har en højere proteolytisk aktivitet end oste, der er fremstillet uden disse enzymer. Arbejder med vækst af 24 stammer af E. faecium og 60 stammer af E. faecalis i skummetmælk ved 37 °C viser, at E. faecalis’ proteolytiske aktiviteter er langt bedre end E. faeciums. Disse resultater bekræftes af og af i mejeriprodukter og af på enterokokker, der er isoleret fra pasteuriserede flydende hele æg og ansvarlige for deres fordærv.

Den efterfølgende nedbrydning af aminosyrer anses for at have stor betydning for udviklingen af osters aroma. Proteolytiske aktiviteter kan også være ansvarlige for dannelsen af biogene aminer af enterokokker fra de aminosyrer, som de (eller andre bakterietyper) har frigivet . Figur 2.6 viser de forskellige biogene aminer, der potentielt kan dannes i fødevarer, der bliver fordærvet.

Figur 2.6. Dannelse af biogene aminer i fødevarematricer som reaktion på mikrobiologiske metaboliske aktiviteter. De grå pile repræsenterer de decarboxyleringsreaktioner, der direkte fører til dannelse af biogene aminer, og de stiplede linjer angiver de biogene aminer, der dannes via metaboliske veje, som adskiller sig fra de et-trins decarboxyleringsreaktioner.

(Figur taget fra , tilpasset i henhold til )

Histamin, tyramin, phenylethylamin og cadaverin fremstilles ved en ettrins-decarboxyleringsreaktion fra deres respektive prækursorer histidin, tyrosin, phenylalanin og lysin. Produktionen af disse biogene aminer, efterfulgt af deres udskillelse, kræver 1) aktive transportsystemer af forløberaminosyrerne, 2) decarboxyleringer og 3) aminudskillelsessystemer, der er resultatet af disse decarboxyleringer. Transporten involverer generelt et protein, der udskifter forstadieaminosyren med den amin, der er resultatet af dens dekarboxylering. Når aminosyren er i cellen, undergår den en decarboxylering, der katalyseres af en specifik decarboxylase (carboxylyaser EC 4.1.1.1.1.) i nærværelse af pyridoxalphosphat. De mest undersøgte decarboxylaser er histidin-decarboxylase (HDC), tyrosin-decarboxylase (TDC) og lysin-decarboxylase (LDC), som er kodet af henholdsvis hdcA-, tdcA- og cadA-generne. De er senere organiseret i operoner med andre gener, der er involveret i andre faser af produktionsprocessen af biogene aminer, såsom transport og modning. Specificiteten af disse decarboxylaser har længe været omdiskuteret, og det er nu veletableret, at en decarboxylase kan decarboxylere flere substrater. Enterococcus TDC kan f.eks. decarboxylere phenylalanin og tyrosin til fremstilling af henholdsvis phenylethylamin og tyramin . Putrescin, agmatin, spermidin og spermine syntetiseres ad forskellige veje, der katalyseres af grupper af gener, som kan være specifikke for arten eller stammen, fordi de potentielt er erhvervet ved horisontal overførsel .

Enterokokker er beskrevet som værende i stand til at forårsage decarboxylaseaktiviteter, der er ansvarlige for produktionen af biogene aminer i fermenterede fødevarer. De er endda anerkendt som havende de stærkeste tyrosin- og phenylalanindecarboxylaseaktiviteter i bakterieverdenen . Mælkesyrebakterier i den endogene flora i fermenterede kødprodukter som f.eks. pølser er anerkendt som de største tyraminproducenter . Oste og visse kødprodukter kan være egnede substrater til produktion af 2-fenylethylamin, tyramin, histidin eller andre aminer. Disse stammer indeholder derfor gener eller operoner, der koder for decarboxylaser eller andre enzymer, der er involveret i syntesen af biogene aminer eller i deres katabolisme . For fisk og skaldyrs vedkommende tilskrives enterokokker ikke syntesen af biogene aminer . Mens varmebestandige bakterier som enterokokker, som er de vigtigste bakterier, der er involveret i produktionen af biogene aminer i mejeriprodukter , kun delvist elimineres ved pasteurisering, reducerer varmebehandling niveauet af biogene aminer. Dette fænomen kan skyldes, at forureningsniveauet i fødevarerne falder, og/eller at en vigtig dekarboxyleringscofaktor er blevet denatureret ved pasteurisering .

Selv om mælkesyrebakterier ikke er særlig aktive over for lipider, er de kendt for at deltage i smagsdannelsen af oste, enten ved omdannelse af kortkædede fedtsyrer til ketoner eller methylerede laktoner eller ved dannelse af aldehyder, der stammer fra oxidation af umættede fedtsyrer og er ansvarlige for udviklingen af rancede lugte og smagsstoffer, enten ved opløsning af aromatiske forbindelser, der er produceret af lipider, men også af proteiner og laktose . Ifølge , og , har enterokokker esteraseaktiviteter, der ofte er stærkere end andre mælkesyrebakterier. Blandt enterokokkerne er disse aktiviteter også variable, og undersøgelser viser, at de er stærkere hos E. faecalis end hos E. faecium. Andre undersøgelser viser, at enterokokkers lipolytiske aktivitet ikke varierer afhængigt af arten, men af den ostetype, som stammen stammer fra.

Allerede i 1965 blev der påvist esteraseaktiviteter hos E. faecalis- og E. faecium-stammer. viser, at enterokokker var mere aktive på triglycerider end Streptococcus-stammer, og at hydrolysesatserne faldt med stigende kulstofkædelængde af de frigivne fedtsyrer (tripropionin > tributyrin > tricaprin > tricaprylin). De fremhæver den manglende aktivitet på triolein. viser, at enterokokker udviser en lav lipolytisk aktivitet, når de anbringes i et vækstmedium, der indeholder sødmælk. Arbejdet viser, at tributyrinhydrolyse udtrykkes af E. faecium og E. faecalis er isoleret fra ost, men at disse stammer ikke er aktive over for mælkeflipider. viser, at en lipase fra E. faecalis også er mere aktiv over for tributyrin end over for tricaproin, tricaprylin og triolein. Ifølge , er enterokokkers evne til at hydrolyse mælkelipider imidlertid meget variabel fra den ene stamme til den anden. Nogle stammer udviser ingen lipolytisk aktivitet, mens andre udviser høj aktivitet på en bred vifte af fedtsyrer. Arbejder udført af , der er udført på syntetiske substrater (4-nitrophenyl-acyler), viser, at E. faecium er aktiv på fedtsyrer med en kædelængde på mellem 2 og 18 kulstofatomer. I efterfølgende undersøgelser viser de samme forfattere, at en intracellulær esterase fra E. faecium in vitro udvikler en aktivitet på 4-nitrophenyl-acyler med en kædelængde på mellem 2 og 12 kulstofatomer med et optimum i tilstedeværelse af 4-nitrophenyl-butyrat (C2) . Arbejdet har vist, at størstedelen af de testede enterokokkerstammer (90 %, N = 129) er i stand til at hydrolytere homogene triglycerider med fedtsyrer med en kædelængde på mellem 4 og 18 kulstofatomer, idet aktiviteten aftager med stigende kulstofkædelængde. Alle de testede stammer (100 %) i samme undersøgelse viser en aktivitet på de syntetiske substrater, fra 4-nitrophenylacetat (C2) til 4-nitrophenylstearat (C18), idet aktiviteten også reduceres ved en forøgelse af fedtsyre-kulstofkædens længde.

I blandt de få offentliggjorte undersøgelser af hydrolytiske aktiviteter, der kan være involveret i fordærv af ægprodukter, er der undersøgelser, som viser lipolytiske aktiviteter udtrykt af stammerne E. faecium og især E. faecalis, der er isoleret fra fordærvede pasteuriserede flydende hele ægprodukter. Arbejdet har vist, at der også er påvist lipaseaktiviteter for halvdelen af de Enterococcus-stammer, der stammer fra industrielle æggehvider, og som er testet for deres evne til at ødelægge en af hovedbestanddelene i flydende ø-desserter, creme fraiche.