De tekniske principper for at kombinere en transkriptionel inkohærent feedforward loop med negativ feedback

En model af inkohærent feedforward transkriptionel regulering

Der er fire varianter af inkohærent feedforward (FF) kontrol i et system med tre knudepunkter. I dette papir undersøger vi det inkohærente feedforward loop type 1 (I1-FFL) motiv, hvor indgangssignalet (X) aktiverer både det mellemliggende (Y) og det endelige output (Z), mens Y undertrykker Z (Fig. 1a) . Vores model er en transkriptionel regulering, således at X repræsenterer en indgående transkriptionsfaktor, som kan binde til de cis-regulerende regioner af Y og Z med affinitet K1 (fig. 1b). Dette resulterer i transkription og translation af Y (dobbelte pile i fig. 1b), som også er en transkriptionsfaktor, der binder sig til den regulerende region af Z med affinitet K2. I vores model er bindingen af X og Y kooperativ (stiplet linje i fig. 1b), således at deres synergistiske binding beskrives ved K12 = CK1K2. Der kan også finde en kooperativ binding sted mellem andre komponenter; der kræves dog ikke anden kooperativitet end den mellem X og Y (se Additional file 1 for analyse af kooperativitet). Derfor beholder vi kun det ene nødvendige kooperative udtryk til at teste vores hypoteser, og derfor antager vi i vores hovedanalyse, at alle andre bindingsinteraktioner er ikke-kooperative.

I procesreguleringsteknik ses X som en forstyrrelse af systemet; målet med standard FF-regulering (som anvender et IFFL-motiv) er at afvise den virkning, som X har på Z. Hvis FF-reguleringen er indstillet korrekt, opretholdes udgangsvariablen på eller i nærheden af den ønskede værdi (f.eks, inden for 5 %), både i den transiente og i den endelige udgang (fig. 1c). I biologiske systemer betragtes X derimod som et indgangssignal, og I1-FFL-motivet er ofte udformet således, at niveauerne af Z udviser et transient respons og derefter vender tilbage (tæt på) deres oprindelige værdi (fig. 1d). Således repræsenterer tophøjden og forskellen mellem det oprindelige og det endelige niveau af Z præstationsmålinger (Fig. 1d).

Her modellerer vi I1-FFL som et system af forsinkelsesdifferentialligninger, som er en udvidelse af modellen fra (Eqs. 1-3 i Metoder). Bemærk, at X aktiverer både Y og Z, med bindingsaffinitet K1, mens Y undertrykker Z (selv om X også er bundet) med bindingsaffinitet K2. Det sidste udtryk i nævneren af fz er kooperativitetstermen (xy/K12 = xy/(CK1K2)). Se Metoder for flere detaljer om modelafledning.

I dette papir holder vi x = x0 = 1 for t < 0, hvilket resulterer i en indledende stationær tilstand med y0 og z0. Til tiden t = 0 oplever x en trinvis stigning: x(t ≥ 0) = x1 > 1, hvilket resulterer i en indledende stigning i både y og z. Efter en vis indledende transient begynder stigningen i y imidlertid også at undertrykke z. For de fleste værdier af parametrene resulterer dette i en topværdi af z (zpeak), efterfulgt af en tilpasning tilbage til en ny stabil værdi, z1 (fig. 1d). Her har vi normaliseret topniveauet og tilpasningsmetrikken som henholdsvis P ≡ (zpeak – z0)/z0 og f = (z1 – z0)/z0 (se fig. 1d). I resten af papiret vil vi tage τy = τz = 1, og θy = θz = 0,5.

Det inkohærente feedforward loop af type I kan indstilles til perfekt tilpasning

Tidligere analyse af ovenstående model (Eks. 1-3) viste, at I1-FFL transkriptionel regulering kan under de rette betingelser fungere som en fold-ændringsdetektor (FCD) . En af de nødvendige betingelser for, at en model kan fungere som en FCD, er næsten perfekt tilpasning (NPA), hvilket sker, når den endelige tilstand, z1, er inden for få procent af den oprindelige tilstand, z0 (f.eks. |f| ≤ ε = 0,05). Mens tidligere arbejde analyserede modellen (Eqs. 1-3) ud fra FCD’s synspunkt, kan modellen (og I1-FFL’er generelt) frembringe flere andre fænotyper, herunder de mindre restriktive fænotyper tilpasning og impulsgenerering.

Vores modelanalyse viser, at det er muligt at indstille FFL’en således, at der opnås perfekt tilpasning (PA). Med andre ord, z1 = z0 (blå kurve i fig. 2a, b). Denne betingelse opnås, når værdien af C for en given K1, K2 er lig med CPA, som er givet ved ligning 5 (se Metoder). Hvis værdien af C afviger lidt fra CPA, går PA tabt, men NPA kan opretholdes. Her definerer vi CNPA+ og CNPA- som de værdier af C, hvor f = henholdsvis + ε og -ε (røde og gyldne kurver i fig. 2a og b). I det meste af dette arbejde har vi sat ε = 0,05; vores resultater påvirkes dog ikke væsentligt af den præcise værdi af ε (se Additional file 1).

Tuning af I1-FFL for næsten perfekt tilpasning. a Dynamikken i output, z(t), ved en trinvis stigning i x fra 1 til 10 på tidspunktet t = 0. Blå kurve: perfekt tilpasning. Rød og gul kurve: næsten perfekt tilpasning, således at |f| = 0,05. b Normaliseret output af z(t). Når kurverne normaliseres, er det tydeligt, at de røde og gule kurver giver en næsten perfekt tilpasning. c Heatmap af den værdi af C, der kræves for perfekt tilpasning givet K1, K2, for en trinvis stigning i x fra 1 til 10. De røde kurver (her og andre steder) repræsenterer konturer, hvis værdier er angivet direkte på plottet. Bemærk, at aksegrænserne for K1 spænder fra stærk (10- 2) til meget svag (106) affinitet, mens de for K2 spænder fra meget stærk (10- 6) til svag (102). d Varmeplan for peak-metrikken, P. Når K1 bliver for lav, falder denne metrik til uacceptabelt lave værdier. e Absolutte niveauer for peak i output. Orange kurver: P = 0,1 og CPA = 0,01. Disse kurver afgrænser sammen med zpeak = 0,01-konturen et biologisk realistisk område af parameterrummet. f Heatmap af det normaliserede interval af C-værdier, hvorunder NPA opnås. De sorte kurver afgrænser to regioner, hvor NPA kan opnås med en hvilken som helst værdi af C. I region I er Y og Z afkoblet og ændrer sig kun lidt ved en stigning i X. Region II beskrives som en FCD-region, som kræver NPA. I den biologisk realistiske region af parameterrummet ligger de værdier for C, hvor NPA kan opnås, mellem 13 og 65% af CPA

For x1 = 10 er et varmekort over CPA-værdierne som funktion af K1, K2, vist i fig. 2c. Bemærk, at samarbejdsvilje er nødvendig for at opnå PA: CPA < 1, selv om den nærmer sig 1 for K1, K2 ≪ 1 (se Additional file 1 og Fig. 2c). Da C repræsenterer en fold-ændrings-kooperativitetsparameter, repræsenterer værdier af C < 1 positiv synergi: Når X er bundet til den regulatoriske region af Z, forbedrer det Y’s evne til at binde og omvendt. En nedre grænse for de rapporterede værdier af C i andre systemer er i størrelsesordenen 0,01 . Da modeller af biologiske processer skal begrænses til biologisk realistiske fænotyper, er det derfor usandsynligt, at PA kan opnås i den øverste højre region af parameterrummet (fig. 2c).

Moderate værdier af parameterrummet svarer til biologisk realistiske fænotyper

I betragtning af den grove nedre grænse for C er det rimeligt at spørge, hvilke andre begrænsninger der kan pålægges modellen. Vi pålægger modellen to yderligere biologisk realistiske begrænsninger. For det første skal den relative topstørrelse, P = (zpeak – z0)/z0, være større end 0,1 for at sikre et signalrespons af høj kvalitet. Et varmekort over P som en funktion af K1, K2 er vist i fig. 2d. Konturen P = 0,1 ligger ved ca. K1 = 0,25; dette indebærer, at hvis X binder Z’s regulatoriske område for tæt, giver en 10-dobbelt stigning i x (fra 1 til 10) ikke en stærk top, da Z-promotoren allerede er mættet, selv ved lave værdier af x.

For det andet skal den absolutte top i z være større end 0,01 (fig. 2e). Da vores model er skaleret således, at den maksimalt mulige værdi af z er 1, svarer dette til 1 % af den maksimalt mulige koncentration af z, givet promotorstyrken og nedbrydningshastigheden. Vi tager zpeak = 0,01 som minimumsværdi for at opnå et biologisk detekterbart signal; man kan dog lempe denne minimumsværdi en smule, hvilket ikke ville påvirke vores resultater væsentligt. Med disse tre begrænsninger på CPA, P og zpeak anses et lille område af K1, K2-parameterrummet for at være “biologisk realistisk”. For kontekstens skyld er alle tre konturer plottet i fig. 2e. Igen kan dette område ændres, hvis der vælges andre værdier for de “biologisk realistiske” begrænsninger. Det skal også bemærkes, at den biologisk realistiske region også afgrænser den region af parameterrummet, hvor I1-FFL kan fungere som en pulsgenerator eller perfekt adaptor (se Additional file 1).

Sensitivitet af NPA med hensyn til I1-FFL-parametre

Robusthed er et yderligere mål, der ofte pålægges biologiske systemer . Derfor analyserede vi intervallet af værdier C omkring CPA, for hvilke NPA opretholdes. Vi definerer ΔCFF ≡ CNPA+ – CNPA-, og plottede et varmekort over ΔCFF/CPA i fig. 2f (se Additional file 1 for afledning af CNPA+ og CNPA-). Der er to regioner i K1, K2-parameterrummet, hvor NPA opnås uanset værdien af C (se Additional file 1 og Fig. 2f), hvoraf ingen af dem befinder sig i den biologisk realistiske region af parameterrummet (hvid stiplet region i Fig. 2f). I region I er værdien af K1 tilstrækkelig lav, således at selv ved x0 = 1 er de regulerende områder af både Y og Z mættet med X, og Y og Z er således relativt ufølsomme over for X (se Additional file 1). I region I er K2 desuden tilstrækkelig stor til, at Y har ringe indflydelse på Z. En stigning i x ændrer således ikke værdien af z nævneværdigt, hvilket betyder, at mens z1 ≈ z0 (således at |f| < ε), er der ikke noget højdepunkt i værdien af z (se Additional file 1: Figur S1). Dette scenario kan ikke rigtig beskrives som NPA. Faktisk er IFFL’s knuder afkoblet i denne region, således at IFFL’s biologiske fænotype eller funktion er utydelig i forhold til to knuder, der handler uafhængigt af hinanden.

Region II er tidligere blevet rapporteret som ikke blot den region, hvor NPA let opnås, men også hvor I1-FFL kan fungere som en foldændringsdetektor (Additional file 1: Figur S2A) . I dette regime, hvor K1 ≫ 1, K2 ≪ 1, og K1K2 < 1, er bindingen af X i det lineære regime, og z afhænger af forholdet mellem x/y . På den anden side er det absolutte respons af Z begrænset til 0,01 % af dets maksimum (Additional file 1: Figur S2B).

I modsætning hertil er ΔCFF i det biologisk realistiske område af parameterrummet begrænset til 13 % — 65 % af CPA (Fig. 2f). For eksempel kan systemet for K1 = 1, K2 = 0,1, for at opretholde målet om NPA, kun tolerere en ∼ 30% forstyrrelse af CPA. Med andre ord er I1-FFL-modellen relativt følsom over for ændringer i C, når det drejer sig om NPA. For at øge systemets robusthed har vi overvejet et kombineret feedforward/feedback-system (FF/FB)

Transskriptionelle negative feedbackkredsløb

I teknikken kan feedforward-reguleringsalgoritmens følsomhed over for modelparametre afbødes ved hjælp af et negativt feedbackkredsløb (se Eks. 6-8 i Metoder). Negativ feedback er faktisk blevet vist at give robusthed af I1-FFL-præstationsmålsætninger, såsom stigningstid og aftagende tid, i en forenklet model af genregulering . I modsætning til den høje frekvens af transkriptionelle FFL-motiver er det imidlertid tidligere blevet rapporteret, at der ikke findes nogen transkriptionelle kredsløb (ud over autoregulering) i modelorganismen E. coli . Yderligere undersøgelser tyder på, at transkriptionel negativ feedback er sjælden, muligvis på grund af den langsommelige karakter af dobbelt-transkriptionelle sløjfer, samtidig med at man anerkender den udbredte brug af blandede negative feedback-sløjfer, hvor den ene gren er transkriptionel og den anden gren er baseret på protein-protein-interaktioner . For at undersøge yderligere analyserede vi et nyligt opdateret datasæt af E. coli transkriptionelle interaktioner og fandt 17 tilfælde af cykler af længde 2, hvoraf fem er positiv feedback, ni er negativ feedback, og tre er blandet . Af disse interaktioner var en af de negative feedbackcyklusser indlejret i flere I1-FFL-strukturer (se Yderligere fil 2).

Et kombineret feedforward/feedback-system er mere robust end et med feedforward alene

Givet forudsigelsen vedrørende effektiviteten af en FB-loop til at udvide robustheden af NPA i et IFFL-motiv, undersøgte vi et kombineret FF/FB-system. Vi tilføjede en fjerde knude, W, som aktiveres af Z og undertrykker Z (fig. 3a, b). Disse interaktioner introducerer flere nye parametre til modellen (se Metoder), herunder to affinitetsbindingsparametre (K3, K4) og en transkription/translationsforsinkelse i W (θw; se Fig. 3b).

Opførsel af det kombinerede FF/FB-system. a Tilføjelsen af W til netværksmotivet resulterer i en negativ feedbacksløjfe, der involverer Z og W. b Illustration af mekanismen for negativ feedback. Z aktiverer W og undertrykkes af W. Illustration af Y er ikke vist (se fig. 1b). c Dynamikken i output, z(t), ved en trinvis forøgelse af x fra 1 til 10 på tidspunktet t = 0 for det kombinerede FF/FB-system. Blå kurve: perfekt tilpasning. Rød og gul kurve: næsten perfekt tilpasning, således at |f| = 0,05. d Normaliseret output af z(t). Når kurverne normaliseres, er det tydeligt, at de røde og gule kurver er afstemt til næsten perfekt tilpasning. Den værdi af C, der er nødvendig for at opnå NPA, er mere fjernt fra CPA end for det rene FF-system. e Heatmap af det normaliserede interval af C-værdier, hvorunder NPA opnås. De sorte kurver, der afgrænser region I og II, svarer til dem, der er beskrevet i fig. 2. I den biologisk realistiske region (defineret for FF/FB-systemet) ligger intervallet af C-værdier, hvor NPA kan opnås, mellem 25 og 100 % af CPA. f Varmekort over forholdet mellem intervallerne af C-værdier, hvor NPA opnås for FF/FB-systemet i forhold til det rene FF-systemet. Tilføjelsen af en FB-sløjfe øger intervallet af værdier for C med 21–54%

For at sammenligne de to systemer direkte har vi plottet forholdet ΔCFFFB/ΔCFF i fig. 3f. For området med biologisk realistiske værdier er ΔCFFFB 21 % — 54 % større end ΔCFF (forhold på 1,21 — 1,54). (Bemærk, at det biologisk realistiske område, der er vist i fig. 3e, f, er for FF/FB-systemet; se Additional file 1: Figur S3). Faktisk er FF/FB-systemet, med undtagelse af et lille område af K1, K2-parameterrummet (nær Region II), altid overlegen i forhold til det rene FF-system (forholdet er større end 1). I betragtning af FF/FB-systemets fordel med hensyn til NPA-målsætninger undersøgte vi dernæst, om FF/FB-systemets dynamiske egenskaber også var fordelagtige.

Som tidligere nævnt forsøgte vi i vores analyse kun at bevare de interaktioner, der var nødvendige for at forklare NPA-fænototypen dens robusthed. Som sådan var det kun interaktionerne mellem X og Y, der omfattede kooperativitet. Vi kan også indarbejde samarbejdsvilje mellem X og W eller Y og W, hvilket ikke kvalitativt påvirker vores resultat, som viser, at tilføjelse af FB-modulet til I1-FFL øger systemets robusthed (Additional file 1: Figur S4). Desuden afhænger vores resultater ikke af det nøjagtige valg af ε (Additional file 1: Figur S5).

Dynamisk analyse afslører, at FF/FB-systemet er overlegen i forhold til systemet med FB alene

Negative feedback loops er plaget af flere ulemper . For det første resulterer proportional feedback (som er den mest almindelige mekanisme, der naturligt forekommer biologiske systemer) altid i offset (se fig. 4a). Med andre ord, efter at en forstyrrelse har forstyrret systemet, vender output ikke tilbage til sin oprindelige værdi. For at afbøde dette kan man øge styrken af den negative feedbackreaktion. Dette resulterer imidlertid ofte i den anden store ulempe ved negativ feedback: Dynamiske ustabiliteter og/eller ringende svingninger kan opstå som følge af stærk negativ feedback, især i systemer med betydelige forsinkelser (fig. 4b) . Hvis den primære forstyrrelse derimod kan afvises helt eller delvist af en FFL, kan begge ulemper undgås (fig. 4a og b). For at undersøge disse principper i et genreguleringssystem sammenlignede vi opførslen af en model med kun FB med en kombineret FF/FB-model. For at illustrere den dynamiske ustabilitet satte vi Hill-koefficienten for alle DNA-bindingsinteraktioner til n = 2 (se Additional file 1).

Dynamikken af systemerne FB alene og kombineret FF/FB. a En (proportional) negativ feedback alene (blå kurve) resulterer ved forstyrrelse altid i forskydning fra den oprindelige værdi. Et tilsvarende kombineret FF/FB-system kan også udvise forskydning; I1-FFL i FF/FB-systemet kan dog indstilles til perfekt tilpasning. FF/FB-systemet kan også have en hurtigere tilnærmelse til stationær tilstand. b Tilføjelsen af en I1-FFL til FB-systemet kan resultere i en mere stabil dynamik. For dette valg af parametre er det rene FB-system ustabilt, mens FF/FB-systemet er stabilt. c Heatmap af den reelle del af den vigtigste egenværdi (α) for det rene FB-system. Den sorte kurve er den kontur, for hvilken α = 0, hvilket angiver stabilitetsgrænsen for det rene FB-system. Mindre værdier af K4 resulterer i et ustabilt system (se del B). Her og andre steder er værdierne af α for andre konturer (røde kurver) angivet direkte på plottet. d Samme som C, men for det kombinerede FF/FB-system. e Heatmap af Δα, forskellen mellem realdelene af de vigtigste egenværdier for de to systemer. På højre side af nulkonturen er værdierne af Δα større end nul, hvilket indikerer, at FF/FB-systemet har en hurtigere tilnærmelse til stationær tilstand. Sorte og hvide kurver angiver stabilitetsgrænserne for henholdsvis det rene FB-system og FF/FB-systemet (se også del C, D)

For at bestemme stabiliteten for både det rene FB-system og det kombinerede FF/FB-system beregnede vi α, realdelen af den primære egenværdi (se Additional file 1), for varierende værdier af K3, K4 (for FF/FB-systemet satte vi K1 = 1, K2 = 0,1; fig. 4c, d). Mens ingen af systemerne er klart overlegne i forhold til det andet, er der ved moderat aktivering af W ved Z (K4 ≈ 0,1 eller mere) en tendens til, at stærk negativ feedback (K3 < 0,1) resulterer i et ustabilt FB-only-system, mens FF/FB-systemet altid er stabilt. Faktisk er αFB – αFFFB > 0 for dette område med moderat aktivering af W (fig. 4e). Selv når begge systemer er stabile, indebærer αFFFB < αFB, at FF/FB-systemet hurtigere når stationær tilstand (se f.eks. fig. 4a). Tilføjelse af endnu et lag af kontrol kan imidlertid ofte resultere i afvejninger, hvor en fordel opnået på ét område resulterer i en ulempe på et andet område. Derfor vil vi sammenligne ydeevnen for den rene FB-model og den kombinerede FF/FB-model med hensyn til to andre mål: normaliseret spidsværdi, P, og absolut spidsværdi, zpeak.

Et kombineret FF/FB-system opnår et kompromis med hensyn til flere mål

For at sammenligne ydeevnen for FF/FB-systemet med den for det rene FB-system beregnede vi spidsværdien af z i begge systemer, mens vi varierede K3, K4 fra 0,01 til 1. Først fandt vi, at den normaliserede topværdi, P, for det eneste FB-system varierede fra ca. 0,7 til 1 (fig. 5a). På den anden side er den normaliserede top for FF/FB-systemet næsten uafhængig af K3, K4-værdierne og er ca. 1,256 (se Additional file 1: Figur S6). Derfor klarer FF/FB-systemet sig også bedre end det rene FB-system på denne måleenhed: FF/FB-systemet er en forbedring på 30-80 % i forhold til det rene FB-system (fig. 5b).

Sammenligning af præstationsmålinger for det rene FB-system med det kombinerede FF/FB-system. a Heatmap af den normaliserede peak, P, for det rene FB-system. Denne parameter (og andre defineret i denne figur) er ikke defineret for ustabile systemer. b Forholdet mellem P for FF/FB-systemet og det for FB alene. I henhold til denne måleenhed klarer FF/FB-systemet sig altid bedre end det rene FB-system. Metrikken PFFFB er imidlertid nogenlunde konstant på 0,46, uanset værdierne for K3, K4 (se Additional file 1). c Heatmap af den absolutte top, Zpeak, for FF/FB-systemet og varierende værdier for K3, K4. Bemærk, at den absolutte topværdi i bedste fald er 0,06. Selv om dette er lavt, er det tilstrækkeligt. d Forholdet mellem den absolutte spidsværdi for FF/FB-systemet og den for FB alene. I henhold til denne målestok klarer det rene FB-system sig altid bedre end FF/FB-systemet (forholdet er mindre end 1). I betragtning af de andre præstationsmål, hvor FF/FB-systemet er bedre, er dette imidlertid en acceptabel afvejning

En stor ulempe ved det kombinerede system er, at med to undertrykkere af output (Y og W) er outputniveauerne (i forhold til dets maksimale mulige niveauer) lave. For de valgte parameterværdier (K1 = 1, K2 = 0,1) forbliver zpeak over den nedre grænse på 0,01 (se fig. 2e). Dette er dog betydeligt lavere end den værdi af zpeak, der ses i systemet med kun FB (fig. 5d). Alt i alt er det kombinerede FF/FB-system overlegen med hensyn til dynamik og normaliseret peakværdi, mens det går på kompromis med den absolutte peakværdi.