Apoenzym

5.11.3 Proteinets rolle – Interaktioner mellem enzym, coenzym og substrat

I alle tilfælde bindes coenzymet til apoenzym uden en dybtgående ændring i absorptionsspektret. Denne observation tyder på, at enzymet ikke forvrænger corrinringen fra dens grundtilstandskonformation i opløsning. Der er imidlertid ingen oplysninger om identiteten af den α-aksiale ligand fra det UV-visible absorptionsspektrum af coenzym-protein-komplekset. Undersøgelser har vist, at den α-aksiale 5,6-dimethylbenzimidazol-ligand er erstattet med en histidin-sidekæde fra det pågældende protein i mindst tre cobalamin-afhængige enzymer: methioninsyntase,4,7 methylmalonyl-CoA mutase,8,45,46 og glutamatmutase.47 I modsætning hertil besætter 5,6-benzimidazol-liganden fra cobalamin stadig den α-aksiale ligandposition i AdoCbl bundet til diol-dehydrase48 og ribonukleotidreduktase (se kapitel 5.08).

For at kunne rumme koordinationen af histidin-sidekæden skal “nukleotidsløjfen” af 5,6-dimethylbenzimidazolbasen, ribofuranosylphosphodiesteren og propionamid-sidekæden svinge væk fra corrinringen og indsættes i en bindingslomme i proteinet. Konsensussekvensen DxHxxG er blevet identificeret i cobalaminafhængige enzymer, der erstatter α-aksialliganden med en histidin-sidekæde.7,49,50 Histidinet, der koordinerer til cobaltatomet, interagerer helt sikkert med aspartatresidensen gennem en hydrogenbinding. Ud over rollen som en koordinerende ligand er den nøjagtige funktion af His/Asp-dyaden som en modulator af enzymatisk aktivitet endnu ikke klarlagt.49 Andre rester i det aktive sted kan også deltage i et udvidet hydrogenbindingsnetværk for at kontrollere reaktiviteten ved metalcentret.7

Adenosylcobalamin-afhængige enzymer skal øge hastigheden af CoC-båndshomolyse med mindst en faktor 1012 for at opnå den observerede katalyseringshastighed.14 Labilisering af adenosylcobalamin kræver svækkelse af CoC-båndet for at tillade homolytisk spaltning. Selv om det ikke er et bevist koncept i cobalamin-afhængige enzymer, kunne tilstrækkelig energi til at forvrænge (svække) CoC-bindingen let komme fra udnyttelsen af overskydende bindingsenergi, der stammer fra flere hydrogenbindingsinteraktioner til cobalamin-kofaktoren, herunder amidsidekæderne, der dekorerer corrinringen.51 Amidsidekæderne er også vigtige genkendelseselementer til binding til de ikke-enzymatiske cobalamintransportproteiner transcobalamin, haptocorrin og intrinsisk faktor.52 Fjernelse eller kemisk derivatisering af specifikke amidsidekæder ændrer bindingen til transkobalamin med 3-40 gange52 , og fuldstændig fjernelse af c-amid-sidekæden giver mulighed for at indføre en yderligere dobbeltbinding i det makrocykliske skelet, hvorved corrinringen udflades med en ledsagende rødforskydning af absorptionsmaksimummet.53

Ud over at fremme den ønskede reaktion udfører adenosylcobalamin-afhængige enzymer en anden vigtig funktion ved at forhindre de uønskede bivirkninger, der ofte ledsager radikale reaktioner.54 Denne funktion af negativ katalyse54 kræver en stærkt begrænset fri energioverflade, der kan forestilles som en dyb kløft, som reaktionen skrider igennem langs den frie energioverflade. Denne canyon skal have stejle vægge for at forhindre sidereaktioner og begrænse det meget reaktive radikale mellemprodukt. I slutningen af reaktionssekvensen slukkes det radikale mellemprodukt ved rekombination af 5′-deoxyadenosylradikalet og cob(II)alamin, hvorved adenosylcob(III)alamin-kofaktoren genetableres i grundtilstand (hviletilstand). Hvis enzymet investerer 25 kcal mol-1 for at fremme homolysen af C-Co-bindingen for at starte den katalytiske cyklus, skal denne energi genvindes ved slutningen af reaktionssekvensen. Genindvinding af energien ville ikke være mulig, hvis en uønsket sekvens af omlægninger fandt sted for at producere et radikal, der er termodynamisk mere stabilt end 5′-deoxyadenosylradikalet. Derfor skal enzymet forhindre alkylradikalet i at omarrangere til et lav-energi-intermediat eller migrere gennem proteinstilladset for at danne et stabilt radikal, der ikke kan deltage i katalysen.55

En paramagnetisk art dannes ikke, før alle reaktionskomponenter er til stede i enzym-substratkomplekset, da dannelse af et coenzym-afledt radikal i fravær af substrat kan føre til uønskede bivirkninger. EPR-eksperimenter med methylmalonyl-CoA mutase46,55 bekræfter, at homolyse af CoC-bindingen først sker efter tilsætning af substrat, hvilket indikeres af fremkomsten af et produktlignende EPR-signal.46 Tilsvarende viser stop-flow spektrofotometriske eksperimenter med ethanolamin ammoniaklyase, at signaturen af cob(II)alamin først optræder i det synlige spektrum, efter at enzym og coenzym er kombineret med mættende niveauer af substrat.56-59

Fotolyse, termolyse og enzympromoveret homolyse af CoC-bindingen af adenosylcobalamin resulterer i singletradikalparret bestående af cob(II)alamin og 5′-deoxyadenosylradikalet.60,61 Da alle disse processer fører til dannelse af det samme radikalpar, kan oplysninger fra reaktionsdynamikken i fotolyseundersøgelser relateres til foreslåede enzymatiske reaktionsmekanismer. Fotohomolyse af adenosylcobalamin begynder med en elektronisk π → π*-fremgang i corrinringen og må involvere en mellemliggende ladningsoverførselstilstand på vej til CoC-båndshomolyse.60,61 Picosecond fotolyseundersøgelser af adenosylcobalamin afslører geminatradikalparrekombinationshastigheder på 109 s-1 med en fraktionel rekombinationseffektivitet i buret, Fc, på ca. 94 %.42,62-64 Nanosecond- og kontinuertbølge fotolyseundersøgelser af cobalaminer bekræfter en effektiv radikalparrekombination i geminatburet med et samlet fotokemisk kvanteudbytte på ca. 20 % for adenosylcobalamin og 35 % for methylcobalamin.65,66 I fravær af enzym rekombineres en stor del af geminatradikalparrene, før der sker en betydelig diffusionsmæssig adskillelse. For at stabilisere 5′-deoxyadenosylradikalet og fremme katalysen skal enzymet øge radikalpars separationsafstand, sandsynligvis gennem en konformationsændring. Uanset mekanismen kræver den høje hastighed af geminat-rekombination i radikalparret, at en af enzymets funktioner er at adskille radikalerne eller midlertidigt fange en af radikalerne for at forhindre for tidlig rekombination.

Og selv om de resulterende singlet {5′-deoxyadenosylradikal:cob(II)alamin}-radikalpar har identiske elektroniske tilstande,59-61,67 kan enzymatisk homolyse af CoC-bindingen ikke få adgang til en exciteret elektronisk tilstand og må begynde med en anden proces for at svække CoC-bindingen og forskyde ligevægten i retning af dissociation (se afsnit 5.11.2). Spaltning forårsaget af belastning vil ikke kun resultere i homolyse af CoC-bindingen, men denne proces vil også øge radikalparseparationsafstanden, hvis en komponent af forvrængningen sker langs den apikale kobaltakse. Denne brute-force-tilgang med at strække CoC-bindingen kan være den mest effektive metode til at opnå både homolyse og et nettofald i hastigheden af radikalparrekombination.

Det er også muligt for enzymet at styrke CoC-bindingen og ugunstigt for homolyse ved at komprimere den apikale Co-α-N-interaktion. De termodynamiske egenskaber af adenosylcobinamidanalogerne + og + blev undersøgt.68 Der blev observeret en stærkere CoC-binding i + med en kortere CoN-bindingsafstand sammenlignet med pyridin som α-aksial base. Den stærkere CoC-binding fører til et betydeligt skift mod heterolyse som den foretrukne vej. I dette modelsystem skal det undersøgte enzym, methylmalonyl-CoA mutase, enten forhindre CoC heterolyse eller følge en heterolytisk vej.68

I methioninsyntase er corrin-delen af cobalamin klemt inde mellem to domæner af et 27 kDa-fragment, hvor nukleotidhalen trænger ind i en dyb lomme dannet af rester af det C-terminale domæne.7,69,70 Denne sekvens indeholder et område med moderat hydrofobicitet, der er flankeret af forlængede hydrofile segmenter.71 Der forventes strukturelle ligheder blandt de domæner, der danner grænseflade med corrinringen. α/β-domænet, der binder den nederste halvdel af corrinringen og rummer den forlængede nukleotidhale (fosfodiesterdelen og 5,6-dimethylbenzimidazolgruppen) i methioninsyntase og methylmalonyl-CoA-mutase, forventes også i glutamatmutase (vide infra).