Alkalisk fosfataseisoenzym

Genomisk struktur, proteinkemi og enzymologi af alkalisk fosfatase

ALP (orthophosphoric-monoester phosphohydrolase, alkalisk optimum, EC 3.1.3.1) findes overalt i naturen i planter og dyr (McComb et al., 1979). Hos mennesker er fire ALP-isoenzymer kodet af fire separate gener (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Tre af isoenzymerne har i det væsentlige vævsspecifik ekspression og betegnes som intestinal, placental og kimcelle-(placental-lignende) ALP. Det fjerde ALP-isoenzym udtrykkes ubiquitært og betegnes derfor TNSALP (Stigbrand og Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Skelet-, lever- og nyrevæv er særligt rigt på TNSALP. De karakteristiske fysisk-kemiske egenskaber (varmestabilitet, elektroforetisk mobilitet osv.) blandt ALP’er oprenset fra menneskelige knogler, lever og nyrer går tabt ved eksponering for glykosidaser (Moss og Whitaker, 1985), og TNSALP er derfor en familie af “sekundære” isoenzymer (jeg vil kalde dem “isoformer”). De er kodet af det samme gen, har den identiske polypeptidsekvens og adskiller sig kun ved posttranslationelle modifikationer, der involverer kulhydrater (Harris, 1980).

Genmapping-symbolet for TNSALP er ALPL (“ALP-liver”), selv om funktionen af TNSALP’s leverisoform ikke er kendt (se senere). ALPL er placeret nær spidsen af den korte arm af kromosom 1 (1p36.1-p34), mens generne for de tarm-, placenta- og kimcelle-ALP’er er placeret ved spidsen af den lange arm af kromosom 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL synes at repræsentere det forfødte gen, mens de vævsspecifikke ALP’er sandsynligvis blev dannet ved genduplikation (Harris, 1990). ALPL er noget større end 50 kb og indeholder 12 exoner, hvoraf 11 oversættes til at danne det modne enzym bestående af 507 aminosyrerester (Weiss et al., 1988b). TATA- og Sp1-sekvenser kan være regulerende elementer, men basal ekspression synes at afspejle “husholdnings”-promotoreffekter, mens differentieret ekspression i forskellige væv kan være medieret af en posttranskriptionel mekanisme (Kiledjian og Kadesch, 1990). ALPL har to promotorer og to tilsvarende 5′-non-kodende exoner, 1a og 1b. Deres ekspression resulterer i to forskellige mRNA’er med forskellige 5′-untranslated regioner (Nosjean et al., 1997). Transkription sker fortrinsvis fra den opstrøms promotor (1a) i osteoblaster og fra den nedstrøms promotor (1b) i lever og nyre (Millán, 2006).

De vævsspecifikke ALP-gener er mindre end ALPL, primært på grund af kortere introner. Aminosyresekvenser udledt fra deres cDNA’er tyder på 87% positionsidentitet mellem placental og intestinal ALP, men kun 50%-60% identitet mellem de vævsspecifikke ALP’er og TNSALP (Harris, 1990).

Aminosyrerestsekvensen af TNSALP indikerer fem potentielle N-linkede glykosyleringssteder (Weiss et al., 1988). N-glykosylering er nødvendig for katalytisk aktivitet. O-glykosylering karakteriserer knogle-, men ikke leverisoformen (Nosjean et al., 1997).

I 2000 blev krystalstrukturen for human placental ALP skitseret med en opløsning på 1,8 Å (Le Due et al., 2000). Det aktive sted for TNSALP ville stamme fra en nukleotidsekvens, der er bevaret i ALP’er i hele naturen (Henthorn og Whyte, 1992), afspejler seks exoner og består af 15 aminosyrerester (Zurutuza et al., 1999).

ALP’er er Zn++-metalloenzymer (McComb et al., 1979). Katalytisk aktivitet kræver en multimerisk konfiguration af identiske underenheder, hvor hver monomer har et aktivt sted og to Zn++-atomer, der stabiliserer den tertiære struktur (Kim og Wycoff, 1991).

ALP’er anses generelt for at være homodimere i kredsløbet (McComb et al., 1979). TNSALP, i sin symmetriske dimeriske form, har αβ-topologi for hver underenhed, herunder et ti-strenget β-ark i midten (Hoylaerts og Millán, 1991). I væv er ALP’er imidlertid bundet (se senere) til celleoverflader, måske som homotetramere (Fedde et al., 1988).

In vitro har ALP’er brede substratspecificiteter og pH-optima, der afhænger af typen og koncentrationen af den fosforforbindelse, der er under katalyse (McComb et al., 1979). Katalytisk aktivitet kræver Mg++ som en cofaktor (McComb et al., 1979). PPi såvel som phosphoestere kan hydrolyseres (Xu et al., 1991). Reaktionen involverer fosforylering-defosforylering af en serinrester. Dissociation af den kovalent bundet Pi synes at være det hastighedsbegrænsende trin. Faktisk er Pi en potent kompetitiv inhibitor af ALP (McComb et al., 1979; Kim og Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Det kan dog også være, at Pi stabiliserer enzymet (Farley, 1991).

Der hersker fortsat usikkerhed om biosyntesen af ALP i højere organismer. Gensekvenserne af de humane ALP-isoenzymer viser, at de nascente polypeptider har en kort signalsekvens på 17-21 aminosyrerester (Harris, 1990) og et hydrofobt domæne ved deres carboxylterminus (Weiss et al., 1988b). Intracellulær nedbrydning af ALP’er kan involvere proteasomer (Cai et al., 1998). Ikke desto mindre er disse ALP’er knyttet til den ydre overflade af plasmamembraner bundet til den polære hovedgruppe af en phosphatidylinositol-glykanenhed (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) og kan frigøres af phosphatidylinositol-specifik fosfolipase (Fedde et al., 1988). Deres præcise interaktion med fosfatidylinositol kan imidlertid være forskellig blandt ALP-isoenzymerne (Seetharam et al., 1987).

Lipidfri ALP er den del, der normalt findes i kredsløbet. Alligevel er mekanismerne for frigivelse af ALP fra celleoverflader ikke kendt. Processen kunne involvere en fosfatidase af C- eller D-typen, detergentvirkning, proteolyse, membranfraktionering eller lipolyse (Alpers et al., 1990).

I sunde mænd og kvinder stammer næsten al ALP-aktivitet i serum eller plasma fra omtrent lige store mængder af TNSALP-isoformerne fra knogle og lever (Millán et al., 1980). Spædbørn og børn, især nyfødte og teenagere, har højere blodbanekoncentrationer af knogleisoformen (McComb et al., 1979). Nogle personer med B- og O-blodtyper, der er “sekretorer”, øger den lille mængde intestinal ALP i deres kredsløb efter indtagelse af et fedt måltid (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). Typisk bidrager intestinal ALP dog kun med nogle få procent til serumets samlede ALP-aktivitet (højst 20 %) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). Placental ALP udtrykkes normalt kun og cirkulerer kun i det sidste trimester af graviditeten (Birkett et al., 1966). Forskellige kræftformer frigiver imidlertid placenta- eller kimcelle-ALP (“placental-lignende”) (Millán, 1988) til blodbanen (Millán, 1988). Clearance af cirkulerende ALP, som for mange andre glykoproteiner, involverer sandsynligvis optagelse og nedbrydning af leveren (Young et al., 1984).