VIROVÁ PLAKETOVÁ ANALÝZA

Materiály:

30ml exponenciální kultury buněk SF9 v množství 5×105 buněk/ml

6jamkových destiček (po 2)

1lahvička 4% agarózového gelu

1lahvička SF-900 (1.3X) médium

1sterilní láhev

0,5 ml baculovirového supernatantu

100 ml SFM

1. Za sterilních podmínek dávkujte 2 ml buněčné suspenze na jamku.

2. Nechte buňky usadit na dno destičky a přikryté inkubujte 1 h při RT.

3. Umístěte lahvičku s agarosovým gelem do vodní lázně o teplotě 70oC. Umístěte prázdnou láhev a SF-900 (1,3X) do lázně o teplotě 40oC.

4. Po 1h inkubaci destiček při RT pozorujte monovrstvy pod inverzním mikroskopem, abyste potvrdili přichycení buněk a 50% konfluenci.

5. Po 1h inkubaci destiček při RT pozorujte monovrstvy pod inverzním mikroskopem. Vytvořte osmilogové sériové ředění odebraného virového supernatantu postupným zředěním 0,5 ml předchozího ředění ve 4,5 ml média SFM ve 12mldispozici. Měli byste skončit s 8 zkumavkami obsahujícími vždy 10-1až 10-8 ředění původní virové zásoby.

7. Postupněodstraňte supernatant z každé jamky, zlikvidujte jej a okamžitě nahraďte 1 ml příslušného virového ředění do každé duplikované jamky. Inkubujte po dobu 1 h při RT.

8. Přesuňte láhve z vodní lázně do sterilní digestoře, když agarosa zkapalní (20 až 30 min). 30 ml média SF-900 (1,3X) a 10 ml 4% agarosegelu rychle dávkujte do prázdné láhve a jemně promíchejte. Vraťte lahvičku s překryvnou vrstvou do vodní lázně o teplotě 40oC, dokud nebude použita.

9. Vraťte lahvičku do vodní lázně o teplotě 40oC. Po druhé 1hodinové inkubaci vraťte lahvičku s naředěnou agarózou a 6jamkové destičky do digestoře.

10. Postupně (od vysokého ředění k nízkému) odstraňte virus z jamek a nahraďte ho 2 ml naředěné agarózy. Pracujte rychle, aby nedošlo k vyschnutí monovrstvy.Pasteurovou pipetou připojenou k vakuové pumpě snadno odstraníte stopy po inokulaci.

11. Před přesunem nechte gel 10 až 20 minut ztuhnout.

12. Inkubujte při teplotě 27oC ve zvlhčeném inkubátoru po dobu 4 až 10 dnů.

13. Inkubujte při teplotě 27oC ve vlhkém inkubátoru.Rekombinantní virus vytváří mléčné/šedé plaky mírného kontrastu viditelné bez barvení nebo jiných detekčních metod.

14.Denně monitorujteplaky, dokud se počet spočítaných plaků po dva po sobě následující dny nezmění.

15.Pro stanovení titru použitého inokula je optimální rozmezí pro počítání 3 až 20 plaků na jamku šestijamkové destičky. Titr (pfu/ml) lze vypočítat podle následujícího vzorce:

16. Překrytí agarózy barvivem Natural Red:

Připravte 0,5% roztok agarózy v SFM

Přidejte roztok přírodní červeně na konečnou koncentraci 50 mg/ml (zřeďte 3,33 mg/ml zásobního roztoku 1:66,6).

Překryjte 1 ml roztoku barviva do každé jamky (na 6jamkové destičce).

Překryjte 1 ml roztoku barviva do každé jamky.