Ubikvitin-proteazomová dráha:

Naše vnímání intracelulární degradace proteinů se v posledním desetiletí dramaticky změnilo. Z mrchožroutského, neregulovaného a nespecifického „koncového“ procesu se stalo jasné, že proteolýza buněčných proteinů je vysoce komplexní, časově řízený a přísně regulovaný proces, který hraje hlavní roli v řadě základních drah během života a smrti buňky. Byly popsány dvě hlavní proteolytické kaskády. Kaspázy se podílejí na programované buněčné smrti (apoptóze), zatímco degradace většiny krátkodobých regulačních buněčných proteinů je zprostředkována cestou ubikvitin-proteazomů. Mezi ně patří regulátory buněčného cyklu a dělení, jako jsou mitotické a G1 cykliny a inhibitory cyklin-dependentních kináz, regulátory růstu, jako jsou c-Fos a c-Jun, nádorové supresory, jako je p53, povrchové receptory, jako je receptor růstového hormonu, a iontové kanály, například regulátor transmembránového vedení cystické fibrózy (CFTR). Systém se také podílí na selektivní proteolýze abnormálních/mutovaných proteinů a na zpracování antigenů omezených na hlavní histokompatibilní komplex (MHC) I. třídy. Objev, že se systém podílí na degradaci c-myc a například na dvoustupňové proteolytické aktivaci NF-κB, signalizoval „vstup“ degradace zprostředkované ubikvitinem do oblasti regulace transkripce. Zdá se, že prostřednictvím degradace krátkodobých a klíčových regulačních proteinů hraje tento systém důležitou roli v řadě základních buněčných procesů. Mezi ně patří regulace buněčného cyklu a dělení, zapojení do buněčné odpovědi na stres a na extracelulární modulátory, morfogeneze neuronálních sítí, modulace povrchových buněčných receptorů, iontových kanálů a sekreční dráhy, opravy DNA, biogeneze organel a regulace imunitních a zánětlivých reakcí. Nejnovější důkazy naznačují, že se tento systém podílí také na apoptóze. Vzhledem k tak širokému spektru substrátů a procesů není překvapivé, že aberace v tomto procesu se v poslední době podílejí na patogenezi několika chorob, a to jak dědičných, tak získaných. Mezi ně patří svalová degenerace, která následuje po denervaci nebo dlouhodobé imobilizaci, některé formy Alzheimerovy choroby, mužská sterilita a Angelmanův syndrom (nedávné přehledy ubikvitinového systému viz ref. 1-4).

Degradace proteinu prostřednictvím ubikvitinové dráhy probíhá ve dvou diskrétních a po sobě následujících krocích: (i) kovalentní navázání několika molekul ubikvitinu na proteinový substrát a (ii) degradace cílového proteinu komplexem 26S proteazomu s uvolněním volného a znovu použitelného ubikvitinu. Aby bylo zajištěno účinné a specifické odstranění určitého proteinu v určitém časovém okamžiku, musí být konjugace ubikvitinu i degradace označených substrátů přísně regulována. Ve studii publikované v tomto čísle sborníku (5) Zhang a jeho kolegové uvádějí identifikaci aktivační oblasti v α podjednotce aktivátoru proteasomu PA28 (REG). Abychom toto zjištění zařadili do příslušného biochemického a fyziologického kontextu, stručně shrneme naše současné poznatky o ubikvitinové proteolytické dráze. Tento systém (znázorněný na obr. 1) se skládá z několika složek, které působí ve vzájemné shodě. Jedna z nich, ubikvitin, evolučně konzervovaný protein o 76 zbytcích, je aktivován na svém C-konci Gly na vysokoenergetický meziprodukt thiolester, což je reakce katalyzovaná enzymem E1, který aktivuje ubikvitin. Po aktivaci jeden z několika enzymů E2 (ubikvitin-nosičové proteiny nebo ubikvitin-konjugační enzymy, UBC) přenese aktivovanou ubikvitinovou část z E1 na člena rodiny ubikvitin-protein ligáz, E3, na který se specificky váže substrátový protein. E3 katalyzuje poslední krok konjugačního procesu, kovalentní připojení ubikvitinu k substrátu. První ubikvitinová část se přenese na ɛ-NH2 skupinu Lys zbytku proteinového substrátu a vytvoří se izopeptidová vazba. V následných reakcích se syntetizuje polyubikvitinový řetězec postupným přenosem dalších aktivovaných molekul na Lys48 dříve konjugované molekuly ubikvitinu. Tento řetězec slouží pravděpodobně jako rozpoznávací značka pro proteasom (viz níže). Ubikvitin K48R nebo metylovaný ubikvitin (u kterého byly všechny volné aminoskupiny chemicky modifikovány) nemohou vytvářet polyubikvitinové řetězce a slouží jako terminátory řetězců. V důsledku toho při nadměrné expresi v buňkách nebo zavedení do bezbuněčných systémů inhibují proteolýzu. Vazba substrátu na E3 je specifická a naznačuje, že E3 hrají hlavní roli při rozpoznávání a výběru proteinů pro konjugaci a následnou degradaci. Struktura systému se zdá být hierarchická: zdá se, že jediný E1 provádí aktivaci ubikvitinu potřebnou pro všechny modifikace. V savčích buňkách bylo charakterizováno několik hlavních druhů enzymů E2. Zdá se, že každý E2 může působit s jedním nebo více enzymy E3. Ačkoli bylo dosud popsáno jen relativně málo enzymů E3, zdá se, že ubikvitin ligázy patří do velké, stále se rozrůstající rodiny enzymů. Pokud jde o způsob rozpoznávání ligáz, je až na několik málo případů nepravděpodobné, že by se každá E3 zaměřovala na jediný substrát. Spíše je možné, že několik různých buněčných proteinů je rozpoznáváno jednou ligázou prostřednictvím podobného, ale zjevně ne identického strukturního motivu. Několik proteinů může být rozpoznáno prostřednictvím jejich volného a „destabilizujícího“ N-koncového zbytku („pravidlo N-konce“; cit.6 ). Naprostá většina buněčných proteinů je však na svých N-koncích acetylována nebo má „stabilizující“ aminokonce a je zaměřena prostřednictvím jiných signálů. Některé jsou rozpoznávány prostřednictvím primárních sekvencí, které se nacházejí za N-koncovým zbytkem. Jiné jsou cíleny prostřednictvím sekundárních posttranslačních modifikací, jako je fosforylace, nebo po spojení s pomocnými proteiny, jako jsou onkoproteiny nebo molekulární chaperony.

Po konjugaci je proteinová část aduktu degradována komplexem proteazomu a uvolňuje se volný a znovu použitelný ubikvitin (nejnovější přehledy o proteazomech viz cit.7-10). Ačkoli v současnosti panuje shoda, že 26S proteasom slouží jako hlavní proteolytické rameno ubikvitinového systému, substrátové spektrum enzymu může být širší a zahrnovat i neubikvitinylované proteiny. Jedním z dobře prostudovaných případů je ornitindekarboxyláza (ODC). ODC je degradována po nekovalentním spojení s antizymem, který může v procesu rozpoznávání fungovat jako chaperon podobný ubikvitinu specifickému pro substrát. Další substráty, většinou proteiny endoplazmatického retikula (ER), mohou být také degradovány proteasomem bez předchozí ubikvitinylace, ačkoli to nebylo pevně stanoveno. Může se jednat například o chybně složené molekuly těžkých řetězců MHC (HC), savčí 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA (HMG-R) a Z variantu α-1-antitrypsinu (α1-ATZ) (přehled v ref. 11). Nyní je také jasné, že ne všechny ubikvitinylované proteiny jsou cílem degradace proteazomem. To platí především pro zralé membránové proteiny na povrchu buněk, jako je receptor růstového hormonu. U těchto proteinů dochází k modifikaci ubikvitinu po vazbě ligandu a je nutná pro jejich endocytózu a nasměrování do lysozomu (přehled v cit. 12). Degradace membránově ukotvených proteinů pomocí ubikvitinového systému vyvolává důležité, dosud nevyřešené mechanistické problémy, které většinou souvisejí s otázkou, jak se spojují dvě topologicky odlišné události, jako je nesprávné skládání v ER a degradace v cytosolu nebo vazba ligandu v extracelulární doméně a ubikvitinylace na cytosolovém ocásku receptoru. U membránových proteinů na buněčném povrchu se zřejmý problém týká úlohy ubikvitinové modifikace: je nutná pro endocytózu značeného proteinu nebo v pozdější fázi pro jeho specifické zacílení a vychytání lysosomem. U proteinů ER degradovaných cytosolickým proteasomem se důležité otázky týkají mechanismů, které jsou základem zpětného získání těchto proteinů přes membránu zpět do cytosolu. Transmembránová doména membránově ukotvených proteinů je hydrofobní a její odstranění z membrány pravděpodobně zahrnuje specializovaný, energeticky závislý, kanálový transport. U lumenálních proteinů ER se otázka soustředí na to, jak jsou transportovány zpět do cytosolu.

Nejnovější důkazy naznačují, že princip modifikace ubikvitinu není omezen na cílení proteinů k degradaci. Ukazuje se, že ubikvitin je členem větší rodiny a bylo popsáno také několik ubikvitinu podobných proteinů. Jeden zajímavý případ zahrnuje cílení do komplexních struktur. Bylo zjištěno, že lokalizace RanGAP1, proteinu aktivujícího Ran GTPasu, do proteinu komplexu jaderného póru RanBP2 je závislá na jediné a stabilní kovalentní modifikaci pomocí 11,5-kDa, 101-reziduálního ubikvitinu podobného proteinu SUMO-1 (13). Aktivační reakce je podobná reakci ubiquitinu a zahrnuje E1 a specifický E2, UBC9. Posttranslační kovalentní modifikace pomocí ubikvitinu a molekul podobných ubikvitinu tedy slouží širokému spektru funkcí. Podílí se na cílení proteinů k degradaci proteazomem a lyzozomem, ale plní také neproteolytické funkce.

Nejlépe prozkoumaným proteazomovým komplexem, který se podílí na degradaci proteinů označených ubikvitinem, je komplex 26S proteazomu. Jedná se o symetrickou strukturu ve tvaru „skořápky“, která se skládá z hlavní katalytické jednotky, soudkovitého proteazomového komplexu 20S, který je z obou stran obklopen regulačními proteazomovými komplexy 19S (19S-20S-19S). Krystalová struktura eukaryotického (kvasinkového) 20S proteasomu byla rozlišena na 2,4 Å (14). Studie potvrdila předchozí předpovědi o struktuře komplexu, ale odhalila i některé nečekané rysy. Kvasinkový komplex je uspořádán jako hromada čtyř prstenců, z nichž každý obsahuje sedm různých podjednotek, α1-7β1-7β1-7α1-7. Tyto podjednotky se skládají ze dvou částí. Jednotlivé podjednotky α a β mají molekulové hmotnosti v rozmezí 25-30 kDa. Aktivní místa se nacházejí ve třech β podjednotkách, β1, β2 a β5, ale ne v α podjednotkách. Topologická analýza umístění jednotlivých podjednotek odhalila, že pro tři různé proteolytické aktivity, trypsinu podobnou, chymotrypsinu podobnou a postglutamylpeptidylhydrolytickou aktivitu, jsou aktivní místa generována sousedními dvojicemi identických podjednotek typu β sídlících v různých β kruzích. Analýza zbytků aktivního místa odhaluje nový druh proteolytického mechanismu. U tří β podjednotek dochází k autokatalýze mezi posledním Gly zbytkem propeptidu a Thr1 zralé podjednotky, který se účastní autokatalytického procesu a stává se podstatnou součástí katalytického místa. Rozlišení krystalové struktury také umožnilo lépe pochopit způsob účinku různých inhibitorů proteasomu. Thr1 v β1, β2 a β5 váže méně specifický inhibitor kalpainu I acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). Laktacystin, specifičtější inhibitor, se může kovalentně vázat na β5, kde může navíc vytvářet řadu vodíkových vazeb s dalšími okolními postranními řetězci. Mutační analýza odhalila, že ostatní podjednotky β, zejména β4 a β7, které se nacházejí v sousedství β5 a β1, ovlivňují aktivitu těchto podjednotek. β6 a β7 také vznikají z pro-proteinů prostřednictvím specifického zpracování. β3 a β4 nejsou zpracovávány. Vzhledem k jejich možné úloze při vytváření mezipodjednotkových kontaktů a stabilizaci komplexní struktury se zdá, že propeptidy jsou nezbytné pro biogenezi a stabilizaci proteasomální struktury a ke zpracování dochází až po sestavení. Struktura krystalu také ukázala, že řetězce α, ačkoli jsou katalyticky neaktivní, hrají zásadní roli při stabilizaci dvoukruhové struktury řetězců β. Musí také hrát roli ve vazbě 19S cap komplexů, ale struktura kontaktů a mechanismy vazby budou objasněny až po vyřešení krystalové struktury 26S komplexu. Krystalová struktura také odhalila vzdálenost 28 Å mezi zbytky Thr1 sousedních aktivních β podjednotek. Tato vzdálenost pravděpodobně určuje délku peptidů vznikajících během proteolytického procesu (≈8-aa zbytků) a vysvětluje úlohu proteazomu při tvorbě antigenních peptidů prezentovaných na molekulách MHC I. třídy. Existence meziproduktů proměnlivé délky však naznačuje existenci druhého hydrolytického místa za Thr1 (viz níže).

Důležitý, dosud nevyřešený problém se týká vstupu proteinových substrátů a výstupu proteolytických produktů z proteazomu. Archeobakteriální (Thermoplasma acidophilum) proteazom obsahuje dva vstupní póry o velikosti ≈13 Å na obou koncích válce obklopené definovanými úseky sedmi řetězců α. Tyto póry se nacházejí na obou koncích válce. V nápadném a poněkud překvapivém kontrastu tyto vstupní porty v eukaryotickém proteazomu 20S neexistují a vstup do katalytické komory mezi řetězci β není z konců komplexu možný. N-koncové domény α1, α2, α3, α6 a α7 vystupují směrem k sobě a vyplňují prostor v několika vrstvách těsně interagujících postranních řetězců. Vstup z konců bude tedy možný pouze po značném přeskupení, ke kterému může potenciálně dojít po spojení s komplexem 19S. Takové přeskupení může také vyžadovat metabolickou energii, kterou může poskytnout ATPázová aktivita několika podjednotek komplexu 19S. Kvasinkový komplex vykazuje některá úzká boční ústí, zejména na rozhraní mezi kruhy α a β . Tyto otvory vedou přímo k aktivním místům Thr1. Jsou pokryta polárními zbytky, které se mohou potenciálně přeskupit a vytvořit ≈10 Å otvory, kterými mohou vstupovat nesložené a prodloužené proteinové substráty.

Regulace aktivity proteazomu 20S probíhá na několika úrovních. Po stimulaci antigen prezentujících buněk interferonem γ jsou tři konstitutivní podjednotky β, 1, 2 a 5, nahrazeny novými a odlišnými podjednotkami β, β1i (LMP2), β2i (MECL1) a β5i (LMP7). Nové podjednotky jsou relativně účinnější při tvorbě antigenních peptidů rozpoznávaných molekulami MHC I. třídy a příslušnými cytotoxickými T-lymfocyty prostřednictvím T-buněčných receptorů. Jiný typ regulace zahrnuje tvorbu komplexů s regulačními komplexy. Proteasom 26S vzniká po ATP-dependentní asociaci komplexu 20S se dvěma komplexy 19S. Komplexy 19S se skládají z nejméně 18 různých proteinů s molekulovou hmotností v rozmezí 25-110 kDa. Tento komplex slouží jako vstupní port do katalytického jádra a zajišťuje různé regulační funkce, které jsou nezbytné k zajištění selektivní degradace substrátů značených ubikvitinem. Patří mezi ně například vazebné místo pro ubikvitinové řetězce, aktivita recyklace ubikvitinu a několik ATPáz, jakož i schopnost stimulovat různé peptidázové aktivity komplexu 20S. Byly skutečně identifikovány podjednotky, které tyto činnosti vykonávají. Zvláště zajímavá je podjednotka vázající ubikvitinové řetězce, která byla popsána jak u savců (S5a), tak u rostlin (MBP1). Tyto podjednotky vážou monomery ubikvitinu; polyubikvitinové řetězce, a zejména ty, které obsahují více než čtyři části, se však vážou s vyšší afinitou. Nedávno byl klonován kvasinkový gen kódující homologní řetězec Mcb1. Překvapivě deleční mutanty Δmcb1 nevykazují žádný růstový defekt a degradují normálně ubikvitinylované proteiny, s výjimkou lineárního fúzního modelového proteinu ubikvitin-Pro-β-Gal. Vykazují však mírnou citlivost na stres, například vystavení analogům aminokyselin (15). Možným vysvětlením těchto neočekávaných výsledků je, že ubikvitinylované proteiny jsou rozpoznávány další, dosud nedefinovanou proteasomální podjednotkou. Jedním z takových kandidátů je deubikvitinylační enzym Doa4, který funguje tak, že odstraňuje ubikvitinové části z proteolytických substrátů. Vzdálenou možností je, že proteasom nerozpoznává ubikvitinové části, ale podobně jako molekulární chaperony se spojuje se špatně definovanými chybně složenými motivy v proteinovém substrátu. Tyto motivy vznikají po „denaturaci“ proteinu ubikvitinovým značením. Identifikace specifičnosti rozpoznávání proteasomu a role, kterou v tomto procesu hraje ubikvitin, jsou zásadní pro pochopení mechanismů působení zejména proteasy a ubikvitinového systému obecně. Další regulační funkce proteasomu 19S zahrnuje úpravu polyubikvitinových řetězců. Komplex obsahuje 37-kDa isopeptidasu, která odstraňuje jednotlivé ubikvitinové části z distálního konce krátkých polyubikvitinových řetězců (16). Předpokládá se, že tato izopeptidáza se podílí na editaci a záchraně špatně ubikvitinylovaných nebo pomalu degradovaných proteinů před degradací. V tomto ohledu se liší od Doa4 a ATP-dependentní izopeptidázy, která je spojena s proteazomem. Oba enzymy se podílejí na recyklaci ubikvitinu a udržování hladiny volného ubikvitinu v buňce.

Dalším komplexem, který se spojuje s proteazomem 20S a výrazně zvyšuje jeho aktivitu, je PA28 (REG neboli regulátor 11S; cit.17 a 18). Na rozdíl od asociace s 19S je tvorba komplexu s PA28 nezávislá na ATP. Po asociaci PA28 zvyšuje Vmax a snižuje Km komplexu 20S vůči celé řadě různých peptidů. Komplex PA28-20S-PA28 je však neaktivní vůči intaktním nativním nebo ubikvitinem konjugovaným proteinům. Čistým aktivátorem je komplex dvou podjednotek o velikosti ≈28 kDa, PA28α a PA28β, které jsou z ≈50 % identické. Imunoprecipitace s protilátkami specifickými pro podjednotky a experimenty s chemickým síťováním odhalily, že PA28 je prstencovitý hexamer, který se skládá ze střídajících se podjednotek α a β se stechiometrií (αβ)3 (19). Je zajímavé, že tyto podjednotky jsou také z 30-40 % identické s jaderným proteinem dosud neznámé funkce, antigenem Ki, který reaguje se séry pacientů s autoimunitním onemocněním systémovým lupus erythematodes. Hexamerický komplex má prstencovou strukturu (obr. 1) a uzavírá komplex 20S proteasomu buď na jedné, nebo na obou koncových deskách. Strukturou uzávěru prochází centrální kanál s 20 Å otvorem na krajním konci a 30 Å otvorem na vazebném povrchu proteasomu (20, 21). Otvory a kanál slouží pravděpodobně jako součást translokačního mechanismu peptidových substrátů na cestě do katalytické komory komplexu 20S. PA28α může vytvářet hexa- nebo hepta-homultimery, které se spojují s komplexem 20S a aktivují jej, i když méně účinně než heteromultimer (αβ)3. Naproti tomu PA28β se s komplexem 20S neasociuje a nemá žádnou stimulační aktivitu. Úloha podjednotek β pravděpodobně spočívá v modulaci aktivity PA28 nepřímým ovlivněním aktivity podjednotek α nebo modifikací afinity částice PA28 k proteazomu 20S.

PA28α obsahuje ve své centrální části unikátní sekvenci, motiv KEKE, což je hydrofilní doména složená ze střídajících se kladně nabitých zbytků Lys a záporně nabitých zbytků Glu. Bylo postulováno, že tento motiv, který se v PA28β nevyskytuje, podporuje protein-proteinovou interakci mezi α podjednotkami částice PA28 a α podjednotkami proteazomu 20S (22). Mutační analýza však odhalila, že ΔKEKE PA28α si zachovává svou stimulační aktivitu (23). Vazba na 20S proteasom však vyžaduje neporušený C terminus PA28α a může zahrnovat C2 α podjednotku 20S proteasomu (8). Předpokládalo se, že fosforylace aktivuje stimulační aktivitu PA28α, nicméně tento způsob regulace nebyl pevně stanoven.

Mutační analýza PA28α provedená Zhangem a kolegy (5) odhalila několik inaktivačních mutací v definované smyčce na bázi molekuly. Některé z mutantních proteinů se těsně vážou na komplex 20S, ale nemohou jej aktivovat (5). Vazbu na proteazom lze tedy jasně oddělit od stimulační aktivity PA28. Zajímavé je, že v distribuci inaktivujících mutací zahrnujících aminokyselinové zbytky 51-122 existuje velká mezera. Tato zóna bez mutací představuje oblast, která je pro každou podjednotku komplexu PA28 jedinečná. Pravděpodobně se nepodílí na interakci PA28 s komplexem 20S ani na stimulaci jeho proteolytické aktivity. Spíše může hrát roli ve funkci částice v intaktní buňce, například v její intracelulární lokalizaci nebo asociaci s jinými složkami, které určují její specifickou aktivitu a interakce.

Důležitý problém se týká fyziologických rolí PA28. Obě podjednotky jsou výrazně indukovány interferonem γ, což naznačuje roli částice ve funkci zpracování antigenu proteazomem. Nadměrná exprese PA28α v linii myších fibroblastů, která exprimuje protein cytomegaloviru pp89, vede k výraznému posílení rozpoznávání cytotoxickými T-lymfocyty specifickými pro pp89. Podobně byla posílena i prezentace chřipkového nukleoproteinu (24). Studie v bezbuněčném systému odhalily, že pomocí koordinovaného mechanismu dvojího štěpení může komplex PA28-20S-PA28 účinně ořezávat velké peptidy (které mají doprovodné sekvence na N i C terminálech) na přesné antigenní epitopy rozpoznávané komplexem MHC a příslušnou cytotoxickou T buňkou (25). Zdá se tedy, že PA28 hraje důležitou roli při zpracování antigenů pro prezentaci na molekulách MHC I. třídy. Protože proteazom PA28-20S-PA28 nemůže trávit intaktní nativní nebo ubikvitinylované proteiny, musí působit následně po proteazomu 19S-20S-19S, který degraduje ubikvitinem označené proteiny nebo velké peptidy. Je také možné, i když to nebylo prokázáno, že existuje jediný asymetrický proteazom 19S-20S-PA28, který může provádět tento dvoustupňový proteolytický proces, počáteční proteolýzu na velké peptidy a konečné ořezání. Symetrické nebo předpokládané asymetrické proteazomy obsahující PA28 se mohou podílet také na terminální degradaci peptidů na volné aminokyseliny, což je činnost, kterou nemůže katalyzovat proteazom 19S-20S-19S (obr. 1). Zdá se tedy, že objasnění buněčných rolí komplexu PA28 bude muset počkat na další experimenty.

.