Ribosomové inženýrství odhaluje význam autonomie 5S rRNA pro sestavování ribosomů

Konstrukce plazmidů

Všechny plazmidy byly konstruovány metodou Gibson assembly50, přičemž páteř plazmidů byla připravena inverzní PCR nebo štěpením restrikční nukleázou a inzerty byly generovány pomocí PCR nebo syntetizovány chemicky společností Integrated DNA Technologies. Plazmidy kódující rRNA byly nejprve elektroportovány do buněk E. coli POP2136 (genotypy všech kmenů použitých v této studii jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1) a transformanty byly obnoveny na LB destičkách doplněných příslušnými antibiotiky; destičky byly inkubovány při 30 °C, aby se zabránilo expresi genů rRNA řízených promotorem lambda PL31. Všechny ostatní plazmidy byly transformovány a množeny v kmeni E. coli JM109 a pěstovány při 37 °C v LB médiu doplněném v případě potřeby 100 μg/ml ampicilinu (Amp), 50 μg/ml kanamycinu (Kan) nebo 50 μg/ml spektinomycinu (Spc).

Konstrukce plazmidu ptRNA100

Plázmidová kostra, včetně původu replikace pA15 a genu rezistence Spc, byla PCR amplifikována z plazmidu ptRNA6751 pomocí primerů NA1 a NA2 (všechny primery jsou uvedeny v doplňkové tabulce 4). Klastr genů tRNA (kódující tRNAAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp a tRNAAsp) pod kontrolou promotoru Ptac a terminátoru T1 byl syntetizován jako gBlock (Integrated DNA Technology). Plazmid pTRNA100 byl vytvořen Gibsonovou montáží. Struktura plazmidu byla ověřena restrikčním štěpením a přítomnost tRNA klastru narozeného v plazmidu byla potvrzena PCR amplifikací pomocí primerů NA3 a NA4 a sekvenováním.

Konstrukce plazmidů pDH42, pDH39 a pCH84

Konstrukty nesoucí hybridní gen 23S-cp5S rRNA byly vytvořeny na základě plazmidu pAM55229, který nese operon rrnB rRNA E. coli. Gen 5S rRNA byl odstraněn pomocí inverzní PCR s použitím primerů NA17 a NA18, které obsahují restrikční místo Xho1, štěpením produktu PCR pomocí Xho1 a ligací DNA. Do genu 23S rRNA byla poté zavedena mutace A2058G pro rezistenci k Ery pomocí mutageneze řízené místem s použitím soupravy QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) s primerem NA7. Výsledný plazmid pAM552Δ5S byl použit k zavedení genů cp5S rRNA s linkery na třech různých místech genu 23S rRNA.

Příprava sekvence cp5S rDNA pro integraci do 23S rDNA byla provedena v jediné PCR reakci, kde byly použity páry primerů NA8/NA9 (pro konstrukty DH39 a DH42) nebo NA26 a NA27 (pro konstrukt CH84) (každý 100 nM), které nesly insert cp5S rDNA, byly kombinovány s dvojicemi primerů (každá 250 nM) zavádějícími náhodné sekvenční linkery o velikosti od 0 do 3 nt na „levém“ a „pravém“ spojení 23S-cp5S takto: Pro vytvoření knihoven plazmidů DH39, DH42 a CH84 byl plazmid pAM552Δ5S otevřen pomocí inverzní PCR s použitím párů primerů NA36/NA37, NA38/NA39 a NA40/NA41 v tomto pořadí: NA10-NA13 a NA14-NA17 pro DH39; NA18-NA21 a NA22-NA25 pro DH42; NA28-NA31 a NA32-NA35 pro CH84. Inzerty rDNA cp5S byly vloženy do výsledných PCR-amplifikovaných plazmidových páteří pomocí Gibsonovy montážní reakce. Reakční produkty byly transformovány do buněk E. coli POP2136 pomocí elektroporace a transformanti byli obnoveni na LB/Amp agarových plotnách kultivovaných při 30 °C (podmínky, které zabraňují expresi rRNA nesené plazmidy). Každá knihovna obsahovala nejméně 3krát více klonů, než je odhadovaná teoretická diverzita 7225 variant. Kolonie byly promyty z destiček LB, plazmidové knihovny byly extrahovány a uloženy.

Záměna ptRNA67 za ptRNA100

Knihovna E. jako výchozí hostitelský kmen byl použit kmen SQ171, který postrádá chromozomální alely rRNA a nese plazmid pCSacB jako zdroj genů rRNA a plazmid ptRNA67 jako zdroj chybějících chromozomálních genů tRNA32,52 . Za účelem nahrazení plazmidu ptRNA67 plazmidem ptRNA100 byly buňky SQ171 nejprve transformovány plazmidem ptRNA-Amp (poskytl Michael O’Connor, University of Missouri, Kansas City), který se podobá plazmidu ptRNA67, ale poskytuje odolnost vůči Amp a obsahuje replikační původ pBR322. Transformanti byli poté zbaveni plazmidu ptRNA67 pasážováním v LB médiu doplněném o Amp a Kan po dobu ~100 generací. Ztráta plazmidu ptRNA67 byla ověřena citlivostí klonů na Spc při replikaci. Výsledný kmen byl poté transformován s ptRNA100 a naočkován na LB agar doplněný Spc a Kan. Transformanti byli pasážováni po dobu ~100 generací na LB médiu doplněném Spc a Kan. Ztráta plazmidu ptRNA-Amp byla ověřena citlivostí jednotlivých klonů na Amp, jak bylo zjištěno při replikaci. Přítomnost ptRNA100 a nepřítomnost ptRNA67 byly navíc ověřeny pomocí PCR a restrikčního štěpení celkových plazmidů připravených ze vzniklého klonu.

Inaktivace genu recA v buňkách SQ171/ptRNA100

Gen recA v kmeni SQ171/ptRNA100 byl inaktivován transdukcí fága P1. Donorový kmen BW25113 recA::cat byl nejprve připraven konvenčním postupem rekombinace52 s použitím kazety rezistence vůči chloramfenikolu (Chl) z plazmidu pKD352. Kazeta byla PCR amplifikována pomocí primerů NA42 a NA43. PCR fragment byl transformován do kmene BW25113 nesoucího plazmid pDK46 exprimující červenou rekombinázu. Po ověření integrace kazety cat a vytvrzení pKD46 byly buňky BW25113 recA::cat použity jako dárci pro fágovou transdukci. Transdukce fágů P1 byla provedena podle standardního protokolu53 s tím rozdílem, že inkubace pro zotavení byla prodloužena z 1 na 3 h před nanesením transduktantů na LB/agar desky doplněné Kan, Spc a 15 μg/ml Chl. Pro vyříznutí kat kazety byl výsledný kmen transformován s plazmidem pZFLP-TetR, který kóduje enzym flipázu, a transformanti byli naočkováni na LB/agar desky doplněné Kan, Spc a 2,5 μg/ml tetracyklinu (Tet). Vyřazení genu cat bylo potvrzeno pomocí PCR a citlivosti klonů na Chl. Poté byl plazmid pZFLP-TetR vyléčen pasážováním buněk po dobu ~100 generací v LB médiu doplněném Kan, Spc a výsledné klony byly testovány na citlivost k Tet. Výsledný kmen byl pojmenován SQA18 (Doplňková tabulka 1).

Vnesení knihoven 23S-cp5S do buněk SQA18

Knihovny plazmidů získané z buněk POP2136 byly transformovány do buněk SQA18 pomocí elektroporace. Po 2 hodinách regenerace při 37 °C byly transformanty naneseny na LB/Amp agarové plotny, které byly následně inkubovány přes noc při 37 °C. Kolonie byly z agarových desek smyty a 0,01 A600 (~106 buněk) bylo umístěno do objemu 2 ml LB média doplněného 150 μg/ml Ery a 0,25% sacharosy. Po 16hodinovém růstu byly buňky naneseny na agarové plotny obsahující Amp, 1 mg/ml Ery a 5 % sacharózy. Destičky byly inkubovány 48 h při 37 °C. Životaschopné kolonie se objevily u knihoven DH42 a CH84, ale ne u knihovny DH39. Několik kolonií, které se objevily na destičkách, bylo testováno pomocí PCR na přítomnost 23S-cp5S rDNA s použitím dvojice primerů NA44/NA45 pro konstrukt DH42 a primerů NA46/NA47 pro konstrukt CH84. Nepřítomnost genu wt 5S rRNA byla ověřena pomocí koloniální PCR s použitím primerů NA48 a NA49.

Výběr preferovaných 23S-cp5S rRNA linkerů

Celková knihovna plazmidů DH42 izolovaná z buněk POP2136 byla transformována do buněk SQA18 a naočkována na LB/Amp destičky, jak je popsáno výše. Kolonie (~50 000) byly promyty z destiček a celkový plasmid byl extrahován z ~109 buněk a použit jako předvýběrová knihovna.

Přibližně 109 buněk bylo poté podrobeno postupu výměny plasmidů. Konkrétně byly umístěny do objemu 20 ml LB média doplněného o 150 μg/ml Ery a 0,25 % sacharózy. Po 4hodinovém růstu byly buňky naneseny na agarové plotny obsahující Amp, 1 mg/ml Ery a 5 % sacharózy. Destičky byly inkubovány 48 h při 37 °C. Kolonie (~50 000) byly z destičky smyty. Extrahovaný celkový plazmid z těchto buněk představoval postselekční knihovnu.

Cp5S rDNA obklopená sekvencemi 23S rDNA a linkery byla amplifikována PCR z plazmidových preparátů předselekční a postselekční knihovny pomocí primerů NA50 a NA51. Knihovny PCR byly podrobeny sekvenování nové generace.

Faktor násobného obohacení pro každou kombinaci linkerů byl vypočten následujícím postupem. Po ořezání adaptéru byla vyřazena celá sekvence cp5S rRNA s výjimkou koncových 4 nukleotidů na každém konci, aby se snížil počet falešných variant sekvence, které se objevily v důsledku chyb v sekvenování v rámci sekvence kódující 5S. Výsledné sekvenční motivy byly spočítány v knihovnách před a po selekci a byla vypočtena frekvence frakce každé varianty linkeru.

Příprava celkové buněčné RNA

Noční kultury kmenů E. coli POP2136 nebo SQA18 byly kultivovány při 30 °C, resp. 37 °C v LB/Amp médiu. Kultury byly naředěny v poměru 1:100 do 2 ml čerstvého média a kultivovány při 37 °C na hodnotu A600 ~ 0,5. Buňky byly sklizeny centrifugací (5000 × g, 1 min) a resuspendovány ve 100 μl lyzačního pufru. Po následném přidání 400 μl extrakčního pufru (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) a inkubaci po dobu 5 min při pokojové teplotě byla celková RNA extrahována fenol/chloroformovou extrakcí. RNA byla vysrážena etanolem, pelet RNA byl promyt 1 ml 70% etanolu, rozpuštěn ve vodě bez RNázy, zamrazen a uchováván při -80 °C.

Analýza ribozomů a polyzomů na sacharózovém gradientu

Noční kultury E. coli byly zředěny do 50 ml média LB/Amp a kultivovány na A600 ~ 0,5. V případě, že byly zředěny do 50 ml média LB/Amp, byly zředěny do 50 ml média LB/Amp. Chl byla přidána na konečnou koncentraci 125 μg/ml a po 5 min inkubace byly buňky sklizeny centrifugací (5000 × g, 10 min, 4 °C). Buněčné pelety byly resuspendovány v ledově chladném lyzačním pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml lysozymu, 0,25 % deoxycholátu sodného a 2U RNázy I bez RQ1). Buňky byly lyzovány třemi cykly zmrazení a rozmrazení. Lyzáty byly vyčištěny centrifugací (20 000 × g, 15 min, 4 °C) a 20 A260 jednotek lyzátu bylo naloženo na 12 ml 10-40% lineárního gradientu sacharózy v pufru 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-merkaptoethanol. Gradienty byly centrifugovány (3 h, 4 °C) při 39 000 otáčkách za minutu v rotoru SW41 (Beckman). Gradienty byly frakcionovány pomocí frakcionátoru (BioComp), přičemž byla zaznamenána absorbance při 254 nm. Frakce odpovídající podjednotkám 50S, ribosomům 70S a polysomům byly sloučeny dohromady. RNA byla izolována extrakcí fenol/chloroform a srážením ethanolem.

Izolace ribozomů 70S a ribozomálních podjednotek

Pro izolaci těsných ribozomů54 byly jednodenní kultury E. coli naředěny do 1 L média LB/Amp a vypěstovány na A600 ~ 0,5. V případě, že se jedná o ribozomy 70S a ribozomální podjednotky, byly tyto kultury naředěny do 1 L média LB/Amp. Buňky byly sklizeny centrifugací (5 000 g, 15 min, 4 °C), resuspendovány v pufru A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-merkaptoethanol, 10 U/ml RNázy I bez RQ1) a lyzovány pomocí francouzského lisu při 10 000 psi. Lyzáty byly vyčištěny centrifugací v rotoru JA25-50 (Beckman) při 13 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při 4 °C a supernatanty byly vloženy do 10 ml 1,1 M sacharózového polštářku připraveného v pufru obsahujícím 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 a 6 mM β-merkaptoethanolu, v 35 ml Quick-Seal odstředivkách (Beckman). Ribosomy byly peletovány centrifugací po dobu 16 h při 36 000 ot/min (4 °C) v rotoru Ti70 (Beckman). Pelet ribosomů byl resuspendován v pufru B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl a 6 mM β-merkaptoethanol) a 100 jednotek A260 bylo naloženo na 10-40% gradient sacharózy připravený v pufru B ve zkumavkách rotoru SW27 (Beckman). Gradienty byly centrifugovány 21 h při 20 000 otáčkách za minutu (4 °C) v rotoru SW27, frakcionovány pomocí gradientového frakcionátoru (BioComp) a frakce obsahující 70S ribosomy a 50S ribosomální podjednotky byly spojeny zvlášť. Materiál byl zahuštěn pomocí 2 ml koncentrátorů Vivaspin (Sartorius) s celulózovou triacetátovou membránou a obnoven v pufru pro skladování ribosomů (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-merkaptoethanol). Alikvoty ribosomů a ribosomálních podjednotek byly bleskově zmraženy a uloženy při -80 °C. V případě potřeby byla rRNA izolována extrakcí fenol/chloroform a srážením ethanolem.

Pro izolaci podjednotek 50S z ribosomů 70S bylo použito 130 pmol ribosomů připravených podle výše uvedeného postupu, ale koncentrovaných peletováním a uložených v pufru pro skladování ribosomů (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-merkaptoethanol) byly zředěny v pufru D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-merkaptoethanol), aby se dosáhlo konečné koncentrace 1,5 mM MgCl2. Ribosomální podjednotky byly separovány centrifugací v 10-40% sacharosových gradientech připravených v pufru D, který obsahoval 1,5 mM MgCl2. Gradienty byly centrifugovány 16 hodin při 27 000 otáčkách za minutu (4 °C) v rotoru SW27 (Beckman), frakcionovány, koncentrovány a obnoveny v pufru pro skladování ribozomů, jak je popsáno výše. Alikvoty byly bleskově zmraženy a uloženy při -80 °C.

LC-MS/MS analýza ribozomálních proteinů

Složení proteinů wt a mutantních těsných ribozomů 70S a ribozomálních podjednotek 50S, připravených výše popsaným způsobem, bylo stanoveno pomocí kvantitativní hmotnostní spektrometrie55. Ribozomální preparáty byly smíchány v molárním poměru 1:1 s wt ribozomy značenými SILAC obsahujícími hmotnostně značený arginin (Arg6: 6HN4O2 a lysin (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Německo). Ribosomální proteiny byly tráveny trypsinem (Sigma) nebo proteázou Lys-C (Wako, USA). Výsledné peptidy byly frakcionovány a analyzovány pomocí LC-MS/MS s použitím LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). Identifikace proteinů a kvantifikační analýza byly provedeny pomocí programů Maxquant v1.5.6.056 a Perseus v1.6.2.357. Vyhledávání v programu Maxquant bylo provedeno pomocí databáze sekvencí proteinů E. coli MG1655 z databáze UniProtKB (24.04.2019). Množství proteinů bylo normalizováno zvlášť pro proteiny velkých a malých podjednotek posunutím průměrného poměru L/M na 1.

Chemická sonda struktury rRNA

Struktura rRNA byla sondována v ribozomech 70S izolovaných z wt nebo mutantních buněk. Ribozomy (10 pmol) byly umístěny do 50 μl modifikačního pufru a aktivovány inkubací po dobu 5 min při 42 °C. Modifikační reakce byla zahájena přidáním 2 μl dimethylsulfátu (Sigma) zředěného 1:10 v ethanolu. Vzorky byly inkubovány 10 min při 37 °C. Modifikační reakce byly zastaveny přidáním 50 μl čerstvě připraveného stop roztoku (600 mM NaOAc, 1 M β-merkaptoethanol) a 300 μl ethanolu. Vzorky byly vysráženy, resuspendovány v pufru (300 mM octan sodný, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5% SDS) a RNA byla izolována extrakcí fenol/chloroform a vysrážením etanolem. Prodloužení primerů bylo provedeno pomocí primerů NA56-NA57.

Analýza obsahu mutantní rRNA

Pro analýzu přítomnosti upravené 23S-cp5S rRNA byla celková RNA izolována z frakcí sacharosového gradientu, jak je popsáno výše. Obsah mutantní 23S-cp5S rRNA byl hodnocen pomocí prodloužení primerů s použitím primerů NA58 nebo NA59. Konkrétně, 5′-značený primer (0,5 pmol) byl žíhán na 1 μg celkové RNA v hybridizačním pufru (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) inkubací při 90 °C po dobu 1 minuty a následným ochlazením během 15 minut na 42 °C a prodloužen pomocí 2 U AMV reverzní transkriptázy (Roche) po dobu 20 minut při 42 °C v konečném objemu reakce 8 µl. Pro primer NA58 obsahovala reakce 0,25 mM ddATP a 0,2 mM dCTP, dGTP, dTTP. Pro primer NA59 obsahovala reakce 0,25 mM ddCTP a 0,2 mM dATP, dGTP, dTTP. Reakce byly ukončeny přidáním 120 μl stop pufru (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70% EtOH), chlazením při -80 °C po dobu 15 min a peletací nukleových kyselin centrifugací při 15 000 × g po dobu 1 h při 4 °C. Supernatant byl odstraněn, pelety byly vysušeny a rozpuštěny v nakládacím barvivu formamidu. Produkty cDNA byly rozděleny ve 12% denaturačním polyakrylamidovém gelu a vizualizovány pomocí fosforového zobrazování.

In vitro translace

In vitro translační reakce byly provedeny v systému Δribosome PURExpress cell-free translation (New England Biolabs). Templáty DNA obsahující promotor RNA polymerázy T7, vazebné místo pro ribosom a sekvenci kódující protein byly připraveny pomocí PCR. Templát ermBL byl připraven pomocí primerů NA52-NA55. Šablona GFP byla vytvořena z genu sf-gfp plazmidu pY71-sfGFP58 pomocí primerů NA31 a NA32. Dihydrofolátreduktáza (DHFR) byla exprimována z plazmidového templátu dodaného se soupravou PURExpress.

Translační reakce pro expresi GFP byla sestavena v celkovém objemu 10 μl a obsahovala 2 μl roztoku A soupravy PURExpress, 1. Roztok PURExpress.2 μl směsi faktorů, 1 μl směsi aminokyselin (každá 3 mM), 1 μl tRNA (20 μg/ml), 16 U inhibitoru RNázy RiboLock (ThermoFisher), 10 ng GFP templátu a 12 pmol wt nebo mutantních ribozomů. Vzorky byly umístěny do jamek 384jamkové destičky s černou stěnou/čirým plochým dnem pro tkáňové kultury (BD Biosciences) a zakryty víčkem. Reakce byly inkubovány při 37 °C v mikrodestičkové čtečce (Tecan), přičemž fluorescence GFP byla zaznamenávána každých 10 min při λexc = 488 nm a λem = 520 nm po dobu 4 h.

Exprese DHFR byla následována inkorporací -L-methioninu do proteinu plné velikosti. Translace byla provedena v 10 μl reakcích sestavených podle výše uvedeného popisu, ale doplněných o 5 μCi -L-metioninu (1175 Ci/mmol), za použití 50 ng templátu DNA a 6 pmol wt nebo mutantních ribosomů. Reakce byly inkubovány při 37 °C. Každých 12 min byly odebrány alikvoty o objemu 1 μl, smíchány s 3 μl barviva pro nakládání gelu obsahujícího SDS a uloženy na ledu až do ukončení průběhu reakce. Proteinové produkty byly analyzovány pomocí SDS-gelové elektroforézy v 16,5% Bis-Tris gelech (Biorad) za použití NuPAGE MES/SDS pufru (Invitrogen). Gely byly obarveny, vysušeny a přes noc vystaveny fosforeskující obrazovce. Radioaktivní pásy byly vizualizovány pomocí fosforimagingu.

Cryo-EM analýza ribozomů 70S a podjednotek 50S

Cryo-EM mřížky byly připraveny následujícím způsobem. 400 M měděné mřížky potažené krajkovým uhlíkem a 2 nm tenkou vrstvou uhlíku (Ted Pella Inc.) byly žhaveny proudem 20 mA se zápornou polaritou po dobu 60S v jednotce žhavení PELCO easiGlow. Přístroj Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) byl předem ekvilibrován na teplotu 4 °C a relativní vlhkost 95 %. Alikvotní část dříve bleskově zmrazených ribosomů byla rozmražena a po zjištění opalescence byl roztok vyčištěn v mikrocentrifuze (10 minut při 16 000 × g při 4 °C). Koncentrace vyčištěného supernatantu byla odvozena z A260 změřené pomocí Nanodropu (ThermoFisher) a ribosomy byly naředěny na 200 nM v LPP pufru. Tři µl 200 nM roztoku ribosomů byly naneseny na mřížku; po 10S prodlevě byla mřížka na 4S rozmazána a poté ponořena do kapalného etanu chlazeného kapalným dusíkem.

Data byla shromažďována na elektronovém mikroskopu Talos (ThermoFisher) pracujícím při 200 KV a vybaveném přímým detektorem elektronů K3 (Gatan Inc.) se zaměřením na 0,5-1,8 μm pod ohniskem. Sběr dat byl automatizován pomocí programu SerialEM59 s využitím náklonu svazku pro sběr několika filmů (např. jeden snímek na středu, 6 s posunem) v každé poloze stolku60. Superrezoluční filmy měly celkem 19 snímků s 1,5 e-/Å2 na snímek, což představuje celkovou dávku 30 e-/Å2 na vzorku. Celkem bylo shromážděno 5222 filmů za 22 h. Filmy byly zarovnány za běhu během sběru dat pomocí IMOD61 k dekomprimaci snímků, použití referenčního zesílení, binování dat superrozlišení na fyzický pixel 0,87 Å na vzorku a korekci driftu obrazu.

Počáteční kroky generování 3D mapy z určení CTF, výběru částic bez reference (489 732 částic) a vytvoření zásobníku byly provedeny v cisTEM. Zarovnání a zpřesnění částic bylo provedeno v programech Frealign 9.11 a cisTEM62,63. Pro urychlení zpracování byly pomocí souboru resample.exe, který je součástí distribuce FREALIGN64 , připraveny 2×, 4× a 8× binované stohy snímků. Výchozím modelem pro zarovnání map částic 70S byl EMD-100365 , který byl zmenšen tak, aby odpovídal 8× binovanému obrazovému stohu pomocí EMAN266. Pomocí 8× binovaného zásobníku byla provedena dvě kola vyhledávání v režimu 3 s odříznutím s vysokým rozlišením 30 Å a poté 20 Å. Poté bylo provedeno 7 kol rafinace v režimu 1 s 4×, případně nezpřehledněným zásobníkem, kdy byly postupně přidávány slupky rozlišení (limit 5 Å) a rozlišení dosáhlo 2,94 Å. Ke zlepšení celkového rozlišení na 2,87 Å bylo použito rafinace s posunem paprsku.

Dvacet kol 3D klasifikace maximální věrohodnosti bez maskování a na rozlišení 14 Å bylo použito k rychlému rozdělení 8× binovaných částic do 12 tříd různého složení odhalujících podjednotky 50S, ribozomy 70S bez tRNA nebo ribozomy 70S s tRNA a 30S v otočené nebo neotočené konformaci (doplňkový obr. 3a). Podsložky 50S částic (133 490), prázdných 70S částic (120 428) nebo 70S částic s tRNA v nerotovaném stavu (55 677) byly vytvořeny pomocí 1x binovaného zásobníku pomocí souboru merge_classes.exe, který je součástí balíčku Frealign, přičemž bylo požadováno skóre částic 0 a minimální obsazení 50 %. Subzásobníky byly poté opět binovány na 4x pomocí souboru resample.exe, aby se urychlily další kroky klasifikace.

Subzásobník částic 50S byl rozdělen do 6 tříd pomocí ohniskové masky o poloměru 55Å kolem části 5S rRNA hybridní rRNA 23S-cp5S. Byly odděleny třídy se slabým nebo chybějícím uL16 a/nebo bL33 a třídy lišící se polohou 5S rRNA. Tyto třídy byly rekonstruovány s původními parametry zarovnání a sklonu paprsku při binningu 1x a jedna z těchto tříd byla použita pro strukturní modelování, jak je podrobně popsáno v následující části.

Byly také zkoumány částice 70S. Prázdný (bez tRNA) substack částic 70S byl rozdělen do 12 tříd pomocí stejné zaostřovací masky 55Å. Tyto třídy vykazovaly rozdíly v obsazení uL16 a/nebo bL33 a poloze 5S rRNA, podobně jako výše popsané třídy 50S. Na rozdíl od částic 50S však 3 z 12 prázdných tříd 70S vykazovaly normálně složenou PTC.

Klasifikace substacku částic 70S vázaných na tRNA v klasickém stavu do 12 tříd se stejnou maskou odhalila téměř stechiometrické obsazení 16 uL a všechny částice měly normálně složenou PTC a silnou hustotu P-tRNA. Naproti tomu obsazení místa A tRNA bylo v některých třídách se slabší hustotou L33 slabé. Klasifikace částic 70S s otočeným 30S a hybridním stavem P/E-tRNA do 12 tříd také odhalila různou obsazenost uL16 a bL33 a sedm tříd vykazovalo aberantní PTC.

Jako výchozí model pro zpřesnění struktury byla použita 3,2Å kryoEM struktura ribozomu 70S vázaného s tRNA A a P67 . Složky/domény ribosomu byly do map dosazeny pomocí programu Chimera68. Zde byly nezávisle na sobě fitovány 50S, stopka L1, stopka L11, tělo a hlava 30S a tRNA. Modelování 5S rRNA a úpravy PTC a dekódovacího centra byly provedeny pomocí PyMOL69. Strukturní modely byly zpřesněny pomocí zpřesnění simulovaným žíháním v reálném prostoru pomocí RS Ref 70,71 oproti odpovídajícím mapám. Parametry zpřesnění, jako je relativní váha stereochemických omezení a experimentální energetický člen, byly optimalizovány tak, aby vznikla optimální stereochemie struktury, korelační koeficient reálného prostoru a R-faktor, který informuje o shodě modelu s mapou72. Omezení sekundární struktury zahrnující omezení vodíkových vazeb pro ribozomální proteiny a omezení párování bází pro molekuly RNA byla použita podle popisu73. Struktury byly následně zpřesněny pomocí phenix.real_space_refine74 a poté následovalo kolo zpřesnění v RSRef s použitím harmonických omezení pro zachování geometrie proteinů70,71. Phenix byl použit k upřesnění B-faktorů modelů oproti jejich příslušným mapám bez filtrování B-faktorů74. Výsledné strukturní modely mají dobré stereochemické parametry, vyznačují se nízkými odchylkami od ideálních vazebných délek a úhlů a těsně se shodují s odpovídajícími mapami, o čemž svědčí vysoké korelační koeficienty a nízké R faktory reálného prostoru (doplňková tab. 2). Obrázky byly připraveny v programu PyMOL69.

Souhrn zpráv

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, která je propojena s tímto článkem.

.