Regulace syntézy cholesterolu

00:00:08.12Jmenuji se Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03a jsem z katedry molekulární genetiky
00:00:12.01na University of Texas Southwestern Medical Center v Dallasu, Texas.
00:00:15.17V této prezentaci,
00:00:17.19budu hovořit o zpětnovazební regulaci HMG CoA reduktázy,
00:00:20.27která je enzymem omezujícím rychlost syntézy cholesterolu.
00:00:25.06Tato prezentace ukazuje strukturu cholesterolu
00:00:27.06a některé vlastnosti této důležité molekuly.
00:00:31.01Cholesterol je sterol,
00:00:33.10který se vyznačuje touto čtyřkruhovou strukturou.
00:00:36.00Tato čtyřkruhová struktura propůjčuje této molekule tuhost,
00:00:39.
00:00:39.Díky tomu je ideální součástí buněčných membrán.
00:00:43.18Protože cholesterol má velký počet
00:00:46.07 vazeb uhlík-uhlík a uhlík-vodík,
00:00:49.02tato molekula je prakticky nerozpustná ve vodě.
00:00:52.07Takže z tohoto důvodu,
00:00:54.13buňky musí být schopny udržovat cholesterol v úzkém rozmezí,
00:00:58.03tak, aby bylo produkováno dostatečné množství cholesterolu pro potřeby buněk
00:01:02.13ale aby nedocházelo k toxickému nadměrnému hromadění cholesterolu.
00:01:06.16Nadměrné hromadění cholesterolu může být na buněčné úrovni toxické.
00:01:12.11Nyní tento slajd ukazuje některé základní funkce cholesterolu.
00:01:15.10Cholesterol je naprosto nezbytný pro život.
00:01:17.26Jak jsem se již zmínil,
00:01:19.27jednou z nejznámějších rolí cholesterolu
00:01:22.26je jeho úloha v buněčných membránách,
00:01:25.08 kde udržuje optimální tekutost membrán.
00:01:29.Ukazuje se, že cholesterol je důležitým prekurzorem
00:01:32.01 pro velmi důležité molekuly, jako jsou steroidní hormony,
00:01:34.25které pomáhají rozlišovat mezi dívkami a chlapci;
00:01:38.19biolové kyseliny, které pomáhají při trávení a výživě tím, že rozpouštějí tuky v potravě a vitaminy rozpustné v tucích;
00:01:47.10a konečně cholesterol je hojně zastoupen v mozku,
00:01:50.18kde se nachází v myelinových pochvách, které obklopují axony
00:01:53.17a pomáhají při synap… synaptických přenosech.
00:01:58.18Buňky v našem těle – savčí… savčí buňky –
00:02:02.01získávají cholesterol ze dvou zdrojů.
00:02:04.21Jeden z těchto zdrojů je znázorněn na tomto slajdu,
00:02:07.06a to prostřednictvím syntézy cholesterolu
00:02:09.19z prekurzoru acetyl CoA.
00:02:13.00Přeměna acetyl CoA na cholesterol
00:02:15.21probíhá působením více než 20 enzymů.
00:02:20.22Jak si můžete představit,
00:02:22.21syntéza cholesterolu zahrnuje produkci několika meziproduktů,
00:02:26.16a tyto meziprodukty samy o sobě
00:02:29.14mohou být také přeměněny na velmi důležité konečné produkty.
00:02:33.11Například tato sloučenina, farnesylpyrofosfát,
00:02:36.29je prekurzorem důležité sloučeniny zvané dolichol,
00:02:40.25která se podílí na N-vázané glykosylaci.
00:02:43.26Je také prekurzorem pro hem a ubichinony,
00:02:46.10které se podílejí na buněčném dýchání;
00:02:49.26vitamín K, který se podílí na srážení krve;
00:02:53.12a nakonec se tento farnesylpyrofosfát a geranylgeranylpyrofosfát
00:02:58.06připojují k mnoha signálním proteinům,
00:03:01.16malé GTP proteiny,
00:03:03.22směřující je k membránám,
00:03:06.12a tato modifikace je naprosto nezbytná pro normální funkci buňky.
00:03:13.04Nyní tento slajd ukazuje, že syntéza cholesterolu
00:03:16.02probíhá v různých tkáních různou rychlostí.
00:03:19.29Nyní játra a nadledvinky
00:03:23.14syntetizují nejvíce cholesterolu v našem těle.
00:03:25.10A měl bych zdůraznit, že to bylo skutečně provedeno na myších,
00:03:28.06ale podobné účinky jsou pozorovány u lidí
00:03:31.07a dalších primátů.
00:03:33.19Játra… játra syntetizují velké množství cholesterolu
00:03:36.24především pro tvorbu lipoproteinů
00:03:39.14a také pro syntézu žlučových kyselin.
00:03:42.10Nadledvinky produkují cholesterol
00:03:45.
.28především pro syntézu steroidních hormonů,
00:03:48.13 zatímco střeva syntetizují cholesterol pro…
00:03:51.27pro dělení buněk.
00:03:54.12Velké množství buněk ve střevech se denně odbourává
00:03:57.12a musí být nahrazeny novými buňkami,
00:03:59.27což vyžaduje výrazné množství syntézy cholesterolu.
00:04:03.28Měl bych také zdůraznit, že střevo je také zdrojem produkce lipoproteinů.
00:04:09.21Takže nyní druhým zdrojem cholesterolu
00:04:12.12je vlastně z lipoproteinů
00:04:15.16které jsou produkovány játry a střevem.
00:04:18.
00:04:18.06Takže, na obrázku je model lipoproteinu o nízké hustotě.
00:04:23.02Je to hlavní nosič cholesterolu v lidské plazmě.
00:04:28.02Takže, lipoprotein o nízké hustotě neboli LDL,
00:04:31.14se skládá z jádra, které je tvořeno volným cholesterolem.
00:04:36.19Takže hydrofobní cholesterol tvoří jádro částice LDL.
00:04:41.19Tento hydrofobní cholesterol
00:04:44.01je obklopen obalem, který se skládá z fosfolipidu
00:04:47.02s různým množstvím esterifikovaného cholesterolu
00:04:51.13 – to je cholesterol, na který byla navázána mastná kyselina –
00:04:55. V tomto případě se jedná o esterifikovaný cholesterol.14který je interkalován do fosfolipidového obalu.
00:04:59.03Celá tato částice LDL
00:05:02.18je obklopena bílkovinou zvanou apolipoprotein B.
00:05:08.02Takže, tento snímek vlastně zobrazuje
00:05:10.17jak buňky získávají cholesterol z těchto dvou zdrojů:
00:05:13.13endogenní syntéza a z LDL.
00:05:18.19Takže, LDL receptory
00:05:21.09– jsou na povrchu buněk —
00:05:23.20se vážou na LDL interakcí s touto částicí apolipoproteinu B
00:05:29.12která obklopuje obal lipoproteinu.
00:05:32.25Jakmile se částice LDL naváže na LDL receptor,
00:05:35.27celý komplex je internalizován do obalených jamek.
00:05:40.06A tyto obalené jamky jsou poté nasměrovány do lysozomů,
00:05:43.07 kde je LDL částice rozložena a cholesterol
00:05:47.15 – volný cholesterol –
00:05:49.25je nyní uvolněn a poskytnut buňce k různým účelům.
00:05:54.18Takže opět tyto dva zdroje buněčného cholesterolu
00:05:58.03 – buď z receptoru… LDL receptorem zprostředkované endocytózy LDL,
00:06:03.07nebo prostřednictvím endogenní syntézy —
00:06:06.02mohou být používány zaměnitelně.
00:06:09.01Tak například, pokud se LDL stane limitujícím,
00:06:12.00buňka přejde na endogenní syntézu svých zdrojů cholesterolu.
00:06:18.02A pokud je endogenní syntéza zablokována,
00:06:20.05tak buňky nyní mohou používat exogenní LDL
00:06:23.01jako zdroj cholesterolu.
00:06:27.00Takže, mluvili jsme o základní funkci cholesterolu.
00:06:30.10Je důležitý v buněčných membránách.
00:06:32.11Je důležitým prekurzorem steroidních hormonů
00:06:34.28a žlučových kyselin.
00:06:36.16Holesterol má však i špatnou stránku,
00:06:38.13a tu ilustruje tento slajd.
00:06:41.00Po řadu let je zvýšená hladina LDL cholesterolu v krvi
00:06:46.14spojena s rizikem ischemické choroby srdeční
00:06:49.19a srdečních infarktů.
00:06:51.16Takže na tomto obrázku vidíte, že
00:06:54.
.27hladina cholesterolu v krvi
00:06:57.26doslova koreluje s rizikem ischemické choroby srdeční.
00:07:01.09A to proto, že zvýšená hladina cholesterolu
00:07:04.21se skutečně může ukládat v tepnách, které vedou do…
00:07:08.12A časem toto ukládání
00:07:11.15vyústí v onemocnění zvané ateroskleróza,
00:07:13.09v němž toto ukládání cholesterolu
00:07:15.04může vést k tvorbě plaků
00:07:17.12které nakonec mohou zablokovat průtok krve do srdce,
00:07:19.18a tím způsobit srdeční infarkt.
00:07:23.06Jedním z nejčastěji předepisovaných léků
00:07:28.16na snížení LDL cholesterolu
00:07:31.11je skupina léků nazývaných statiny.
00:07:33.03Zde je zobrazena typická základní struktura statinů
00:07:37.26a některé z různých forem statinů
00:07:41.29které byly využity v klinice.
00:07:44.22V průběhu let se statiny
00:07:47.12staly jedním z nejpoužívanějších… nejprodávanějšími léky…
00:07:49.10léky ve Spojených státech
00:07:51.20protože mají schopnost snižovat hladinu LDL cholesterolu v krvi.
00:07:57.19Takže, v tomto experimentu je zobrazen souhrn nejméně čtyř studií
00:08:02.23které odhalují, že statiny skutečně snižují hladinu LDL cholesterolu
00:08:06.06a toto snížení vede ke snížení výskytu
00:08:10.04koronárních srdečních onemocnění.
00:08:12.11Takže, zde zobrazené v uzavřených kruzích jsou klinické studie
00:08:15.V každé z těchto studií vedla léčba statinem k poklesu hladiny LDL cholesterolu,
00:08:20.22nebo placeba.
00:08:22.11A v každé z těchto studií vedla léčba statinem k
00:08:25.17poklesu hladiny LDL cholesterolu,
00:08:28. V každé z těchto studií vedla léčba statinem k poklesu hladiny LDL cholesterolu.06a tento pokles hladiny LDL cholesterolu
00:08:31.19 vedl ke snížení počtu koronárních příhod, tj. srdečních infarktů.
00:08:35.13Takže se nabízí otázka, jak statiny fungují?
00:08:38.21A co statiny dělají?
00:08:40.28Takže, nejprve jsme si odpověděli, co statiny dělají?
00:08:43.16Takže, statiny inhibují enzym HMG CoA reduktázu.
00:08:47.05HMG CoA reduktáza katalyzuje
00:08:50.20rychlost limitující krok v syntéze cholesterolu.
00:08:53.28Je to vlastně čtvrtý krok na cestě syntézy cholesterolu.
00:08:58.06Statiny tedy kompetitivně inhibují HMG CoA reduktázu
00:09:01.20 tím, že napodobují produkt reduktázové reakce,
00:09:05.13mevalonát.
00:09:07.20Tato kompetitivní inhibice reduktázy
00:09:10.19 je základem schopnosti statinů snižovat hladinu
00:09:14.18LDL cholesterolu v krvi.
00:09:18.07Takže, jak statiny fungují?
00:09:20.17Takže, opět, kompetitivní inhibicí HMG CoA reduktázy,
00:09:24. Statiny jsou schopny snížit hladinu cholesterolu v krvi.01To vede k poklesu množství mevalonátu
00:09:27.09a samozřejmě k poklesu cholesterolu.
00:09:30.18Tento úbytek cholesterolu vede ke zvýšení
00:09:33.12přepisu genu
00:09:36.06kódujícího LDL receptor.
00:09:37.25A v důsledku toho se zvýší počet LDL receptorů na povrchu…
00:09:41.14zejména jaterních buněk,
00:09:43.15a toto zvýšení počtu LDL receptorů vede
00:09:48.01ke zvýšenému nebo zvýšenému vychytávání LDL z krve.
00:09:52.25A toto snížení LDL v krvi
00:09:55.26je zodpovědné za snížení koronárního srdečního onemocnění
00:09:58.20u pacientů léčených statiny.
00:10:02.12Klinické účinky statinů
00:10:05.26jsou však ve skutečnosti otupeny
00:10:09. V důsledku toho dochází ke snížení hladiny LDL v krvi.06kompenzační zvýšení HMG CoA reduktázy
00:10:11.10, které doprovází léčbu statiny.
00:10:13.19A to je znázorněno na tomto slajdu.
00:10:15.13 Toto je imunoblot proteinu HMG CoA reduktázy
00:10:19.03v játrech myší, kterým byl podáván statin,
00:10:22.17nebo dokonce v kultivovaných buňkách
00:10:25.00, které byly léčeny statiny in vitro.
00:10:26.24A jak vidíte,
00:10:28.20 léčba statiny způsobuje výrazné nahromadění
00:10:31.09 HMG CoA reduktázy.
00:10:33.10A tato akumulace, jak jsem již zmínil,
00:10:35.24snižuje klinické účinky statinů.
00:10:38.12Naší další otázkou tedy je, proč statiny způsobují
00:10:41.27 akumulaci HMG CoA reduktázy na tak vysokou úroveň?
00:10:44.14Která byla odhadnuta na
00:10:47.02nejméně 200násobek.
00:10:49.29Takže normálně HMG CoA reduktáza
00:10:51.25podléhá obrovské zpětnovazební regulaci.
00:10:55.02A tato zpětnovazební regulace je zčásti zprostředkována
00:10:57.29steroly.
00:11:00.02Léčba statiny, jak jsem již zmínil,
00:11:02.05blokuje aktivitu HMG CoA reduktázy,
00:11:04.12a zabraňuje syntéze těchto sterolových molekul.
00:11:07.29A samozřejmě, že zabránění syntéze sterolů
00:11:10.26je vlastně zodpovědné za regulaci LDL receptorů
00:11:14.17a následné snížení LDL cholesterolu.
00:11:18.09Protože však statiny
00:11:21.03blokují syntézu sterolů,
00:11:22.18přerušují zpětnovazební regulaci reduktázy.
00:11:25.14A v důsledku toho dochází ke třem událostem.
00:11:27.28Za prvé, v důsledku tohoto snížení cholesterolu
00:11:31.09a dalších produktů syntetické dráhy cholesterolu,
00:11:35.08dojde ke zvýšené transkripci genu reduktázy,
00:11:39.07dojde ke zvýšené translaci
00:11:41.28mRNA reduktázy,
00:11:43.17a nakonec je zde zvýšená stabilita
00:11:45.24 proteinu reduktázy.
00:11:47.13Tyto tři události jsou tedy zodpovědné
00:11:49.19za výrazné zvýšení proteinu reduktázy
00:11:52.03, které jsem vám ukázal na předchozím slajdu.
00:11:55.18Takže, v průběhu let,
00:11:57.06má laboratoř se zajímala o snahu pochopit
00:11:59.27molekulární mechanismy, které stojí za
00:12:02.22touto zvýšenou stabilitou proteinu,
00:12:04.09a to bude předmětem zbývající části této prezentace.
00:12:09.16Takže, tento snímek ilustruje, že steroly
00:12:13.08vskutku urychlují degradaci
00:12:15.26 HMG CoA reduktázy.
00:12:17.14Takže, v tomto experimentu,
00:12:19.11použili jsme klasickou pulzní analýzu
00:12:20.29pro sledování stability reduktázy v buňkách
00:12:23.16které byly ošetřeny v nepřítomnosti nebo přítomnosti sterolů.
00:12:26.00Takže, to, co zde děláme, je, že typicky značíme buňky radioaktivitou,
00:12:29.27malou podmnožinu molekul HMG CoA reduktázy.
00:12:33.25Tuto radioaktivitu pak odebereme,
00:12:35.25a pak sledujeme pres…
00:12:37.25stabilitu proteinu reduktázy
00:12:39.26v nepřítomnosti nebo přítomnosti sterolů.
00:12:44.10A jak můžete vidět zde,
00:12:46.08když jsou buňky chovány v médiu
00:12:49.07které neobsahuje radioaktivitu,
00:12:51.01v nepřítomnosti sterolů
00:12:52.28reduktáza je poměrně stabilní v čase.
00:12:55.16Jak však vidíte,
00:12:57.21přídavek sterolů do honicího média
00:12:59.26způsobuje výrazné snížení hladiny reduktázy.
00:13:02.20To opět svědčí o urychlené degradaci sterolů
00:13:06.04 HMG CoA reduktázy.
00:13:09.16K pochopení molekulárních mechanismů
00:13:11.22pro tuto steroly indukovanou degradaci reduktázy,
00:13:14.15musíme pochopit strukturu proteinu HMG CoA reduktázy.
00:13:18.05A doménová struktura reduktázy
00:13:20.14je vlastně znázorněna na tomto slajdu.
00:13:22.18Takže, HMG CoA reduktáza
00:13:24.16se skládá ze dvou odlišných domén.
00:13:26.28Má N-koncovou doménu
00:13:29.
.06která ukotvuje protein v membránách endoplazmatického retikula,
00:13:32.14nebo ER.
00:13:35.00Tato N-koncová doména,
00:13:36.29kterou označujeme jako membránovou doménu,
00:13:39.04obsahuje osm membránových oblastí.
00:13:42.05A za ní následuje druhá doména HMG CoA reduktázy,
00:13:45.07kterou nazýváme katalytickou doménou.
00:13:47.24Takže katalytická doména vystupuje do cytosolu buněk
00:13:51.24a obsahuje veškerou enzymatickou aktivitu HMG CoA reduktázy.
00:13:56.03Ve skutečnosti zkrácená verze reduktázy
00:13:59.29která obsahuje pouze katalytickou doménu
00:14:02.13může zcela zachránit syntézu mevalonátu
00:14:06.28v buňkách, které postrádají HMG CoA reduktázu.
00:14:10.13Takže katalytická doména je nezbytná i dostačující
00:14:13.01pro syntézu mevalonátu.
00:14:15.29Což pak vyvolává otázku,
00:14:17.28proč je tento protein vázán na membránu?
00:14:19.26A ukazuje se, že reduktáza
00:14:22.02je vlastně membránově vázaná bílkovina už u kvasinek.
00:14:25.18Takže funkce membránové domény reduktázy
00:14:28. Jaká je její funkce?26byla ilustrována v tomto raném experimentu
00:14:31.27který porovnával stabilitu katalytické domény
00:14:35.08 – která, nezapomeňte, obsahuje veškerou enzymatickou aktivitu –
00:14:37.26s enzymem plné délky.
00:14:40.20A opět byla použita jednoduchá pulzní analýza
00:14:42.21pro sledování stability těchto dvou proteinů.
00:14:47.13Jak můžete vidět na panelu vlevo,
00:14:49.03zkrácená katalytická doména vytváří
00:14:53.14velmi stabilní protein, který… což je důležité,
00:14:57.08jeho degradace není ovlivněna steroly.
00:14:59.20Naproti tomu protein plné délky – který opět obsahuje membránovou doménu –
00:15:03.07je méně stabilní, a to i v nepřítomnosti sterolů.
00:15:06.13A můžete vidět, že steroly výrazně urychlují
00:15:09.25degradaci HMG CoA reduktázy,
00:15:12.09což naznačuje, že membránová doména…
00:15:15.12funkce membránové domény
00:15:17.25je pro tuto steroly urychlenou nebo steroly indukovanou degradaci.
00:15:22.08Takže to, co naznačovaly předchozí studie
00:15:25.12je, že membránová doména reduktázy
00:15:28.03je nezbytná a dostačující pro degradaci urychlenou steroly,
00:15:30.25a naznačily, že membránová doména,
00:15:33.16buď přímo nebo nepřímo,
00:15:35.16může detekovat intracelulární hladiny sterolů.
00:15:38.00A detekce vede možná k tomu,
00:15:41.02konformační změnu v membránové doméně reduktázy
00:15:43.29která způsobuje, že protein je náchylný k rychlé degradaci.
00:15:48.14A protože statiny samozřejmě blokují syntézu cholesterolu,
00:15:52.01statiny skutečně blokují toto
00:15:54.22což nazýváme degradace spojená s ER – neboli ERAD –
00:15:57.08 HMG CoA reduktázy.
00:16:02.23Takže, klíčový průlom v našem chápání
00:16:04.23 ERAD HMG CoA reduktázy
00:16:06.15přišel s objevem dvojice proteinů
00:16:08.28– ER membránové proteiny —
00:16:10.23zvané Insig-1 a Insig-2.
00:16:14.15Tyto Insig proteiny jsou pro účely této přednášky
00:16:16.27velmi nadbytečné.
00:16:18.14Vykonávají nadbytečné role při degradaci neboli ERAD,
00:16:22.06 HMG CoA reduktázy.
00:16:24.00Jsou identické… jsou asi z 85 % identické,
00:16:26.23a jsou to vysoce hydrofobní proteiny.
00:16:29.24Úloha Insigs v ERAD HMG CoA reduktázy
00:16:34.28byla poprvé ilustrována v tomto experimentu.
00:16:37.19Takže, i zde jsme použili pulzní analýzu
00:16:40.15pro měření degradace urychlené steroly
00:16:43.29reduktázy v buňkách
00:16:47.02, které byly buď transfekovány kontrolními molekulami,
00:16:51.06tzv. siRNA,
00:16:53.05nebo buňky, které byly transfekovány siRNA
00:16:55.26které by vedly k vyřazení exprese
00:16:58.13 jak Insig-1, tak Insig-2.
00:17:02.07A jak můžete vidět na panelu vlevo,
00:17:04.13v buňkách transfekovaných kontrolní siRNA,
00:17:08.04steroly výrazně urychlují degradaci
00:17:12.07 HMG CoA reduktázy.
00:17:14.13Takže, otevřené kruhy jsou experimenty prováděné v nepřítomnosti,
00:17:17.09a uzavřené kruhy jsou experimenty prováděné
00:17:20.15v přítomnosti sterolů.
00:17:22.12A co můžete snadno vidět, je, že vyřazení Insig-1 a Insig-2
00:17:26.23úplně zruší degradaci urychlenou steroly,
00:17:30.02 což naznačuje, že tyto proteiny
00:17:32.28hrají v tomto procesu klíčovou roli.
00:17:35.27Naší další otázkou tedy je,
00:17:38.02jaký je mechanismus,
00:17:39.26kterým insigy urychlují ERAD HMG CoA reduktázy?
00:17:47.09Tento experiment…
00:17:48.21tento snímek ukazuje, že inhibitory proteasomu, 26S proteasomu,
00:17:53.21blokují degradaci HMG CoA reduktázy vyvolanou steroly.
00:17:57.15Takže, jak můžete vidět v tomto experimentu…
00:18:00.18v prvních dvou pruzích, steroly způsobily výraznou degradaci reduktázy,
00:18:04. To znamená, že se reduktáza výrazně rozložila.17a tato degradace je zcela zablokována
00:18:06.19pokud jsou tyto buňky ošetřeny inhibitorem proteazomu.
00:18:12.03Takže s… to nám umožňuje vytvořit další model
00:18:15.27ve kterém opět membránová doména reduktázy
00:18:18.25buď přímo, nebo nepřímo
00:18:21.22snímá hladiny intracelulárních sterolů,
00:18:24.15to způsobí, že se reduktáza naváže na Insig,
00:18:28.12a tato vazba Insig vede k reakcím, které způsobí, že reduktáza
00:18:32.06je nyní degradována proteazomem 26S.
00:18:37.22Je známo, že většina substrátů proteazomů
00:18:41.00vyžaduje jejich předchozí ubikvitinaci.
00:18:44.05Ubikvitinace je proces, při kterém
00:18:46.
.23malý protein ubikvitin kovalentně naváže
00:18:50.16na molekuly substrátů.
00:18:52.08A jakmile je řetězec ubikvitinů
00:18:54.16navázán na substráty,
00:18:56.08je rozpoznán proteazomy k degradaci.
00:19:00.25Nyní se tomu říká polyubikvitinace,
00:19:02.25a polyubikvitinace proteinů
00:19:05. V tomto případě se jedná o polyubikvitinaci proteinů.14vyžaduje působení nejméně tří různých typů enzymů.
00:19:07.29To je znázorněno na tomto slajdu.
00:19:11.09V prvním kroku se
00:19:13.15ubikvitin aktivuje
00:19:15.20v závislosti na ATP enzymem zvaným E1,
00:19:19.11neboli ubikvitin-aktivující protein.
00:19:22.15V dalším kroku je ubikvitin přenesen z E1 do…
00:19:27.13do dalšího enzymu zvaného E2 neboli ubikvitin-konjugujícího enzymu.
00:19:32.16V posledním kroku se E2 spojí s E3,
00:19:36.24neboli ubikvitin ligázou,
00:19:39. V posledním kroku se E2 spojí s E3,
00:19:36.24.08která se zase spojí se substrátem,
00:19:42.09který je zde znázorněn zeleně.
00:19:44.11Čím se E3 zabývá, je usnadnění přenosu ubikvitinu
00:19:47.27z ubikvitin-konjugujícího enzymu
00:19:50.00na lysinový zbytek v substrátovém proteinu,
00:19:53.08vytváří ubikvitinovaný substrát.
00:19:57.28Tento proces probíhá mnohokrát,
00:20:00.
.02až se na substrátovém proteinu vytvoří ubikvitinový řetězec.
00:20:06.02Ten může být nyní rozpoznán proteazomy k degradaci.
00:20:10.18Takže vzhledem k tomu, že tyto proteiny Insig
00:20:12.26jsou nutné pro degradaci reduktázy,
00:20:15.08a že reduktáza je skutečně degradována proteazomy,
00:20:19.02naší další otázkou je, zda je reduktáza ubikvitinována?
00:20:23.20Tato otázka byla zodpovězena v tomto experimentu
00:20:26.11uvedeném na tomto slajdu.
00:20:28.21Takže v tomto experimentu jsme ošetřili buňky
00:20:31.15v nepřítomnosti a přítomnosti sterolů
00:20:33.20a inhibitoru proteazomu.
00:20:37.05Po těchto ošetřeních,
00:20:39.11jsme imunoprecipitovali reduktázu
00:20:41.21a poté tyto imunoprecipitáty prozkoumáme buď na celkovou reduktázu,
00:20:43.20zobrazenou na spodním panelu,
00:20:45.18nebo na ubikvitinovanou reduktázu.
00:20:49.07Takže, jak můžete vidět v prvním pruhu,
00:20:51.01i když je reduktáza v těchto experimentech stažena dolů,
00:20:55.11nevidíme žádnou reaktivitu s ubikvitinací.
00:20:58.14Steroly však způsobují, že se reduktáza ubikvitinuje.
00:21:03.09A tato ubikvitinace je výrazně zvýšena
00:21:07.22pokud zahrneme také inhibitory proteasomu.
00:21:09.27Takže nám to naznačuje, že steroly
00:21:12.16vskutku způsobují, že se reduktáza ubikvitinuje,
00:21:14.20a tento ubikvitinovaný protein je nyní degradován proteazomy,
00:21:17.
.18jak ukazuje stabilita ubikvitinované reduktázy
00:21:21.21těmito proteasomovými inhibitory.
00:21:24.27Naší další otázkou je,
00:21:27.07Jsou pro tuto steroly indukovanou ubikvitinaci reduktázy nutné Insigy?
00:21:32.16A opět se obrátíme k siRNA.
00:21:35.08Buňky byly transfekovány buď kontrolní siRNA
00:21:38.18nebo siRNA proti Insig-1 a -2.
00:21:41.03Tyto buňky jsme pak ošetřili v nepřítomnosti nebo přítomnosti sterolů,
00:21:43.20a poté jsme provedli sondování ubikvitinované reduktázy.
00:21:47.16A jak můžete vidět v prvních dvou pruzích,
00:21:49.10reduktáza je pěkně ubikvitinovaná v přítomnosti sterolů,
00:21:52.08a vyřazení Insig-1 a Insig-2
00:21:56.02úplně zruší tuto ubikvitinaci.
00:22:01.01To nám nyní umožňuje zaplnit další mezery v našem modelu
00:22:04.07 pro ERAD HMG CoA reduktázy zprostředkovanou Insigem.
00:22:09.
.14Nyní se ukázalo, že podskupina molekul Insig
00:22:12.00skutečně asociuje s komplexem E3/E2 ubikvitin ligázy.
00:22:16.27Znovu, v přítomnosti sterolů,
00:22:20.15membránová doména reduktázy
00:22:23.03senzorizuje sterol,
00:22:24.25a tato senzorika způsobí, že se reduktáza naváže na Insigs,
00:22:27.28a samozřejmě tyto Insigs
00:22:31.13tedy přemostí reduktázu s komplexem E3/E2 ubikvitin ligázy.
00:22:36.26Toto přemostění pak vede k ubikvitinaci reduktázy
00:22:40.00na dvou lyzinových zbytcích v membránové doméně.
00:22:43.17A tato ubikvitinace pak způsobí, že reduktáza
00:22:46.17je odstraněna z membrány ER
00:22:50.09a následně degradována proteazomy,
00:22:52.
.22prostřednictvím procesu, který nejsme zcela…
00:22:55.07prostřednictvím procesu, který není zcela pochopen.
00:23:00.20Takže, shrnuto, dnes jsem vám řekl
00:23:03.16že HMG CoA reduktáza je enzym omezující rychlost
00:23:06.07v dráze syntézy cholesterolu,
00:23:08.01a je cílem těchto statinových léků snižujících hladinu cholesterolu.
00:23:11.26Reduktáza je řízena prostřednictvím velmi složitého
00:23:15.16zpětnovazebního regulačního systému
00:23:18.01který je zprostředkován cholesterolem a dalšími typy sterolů.
00:23:20.18A že statiny narušují tento zpětnovazební regulační systém,
00:23:24.03částečně tím, že blokují tuto Insigem zprostředkovanou ubikvitinaci
00:23:27.10a ERAD HMG CoA reduktázy.

.