Plasmidově zprostředkované geny CITM a DHAM pro ampC β- laktamázu u gramnegativních klinických izolátů

Úvod

U některých gramnegativních bakterií (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii a Pseudomonas aeruginosa) se objevila a celosvětově rozšířila rezistence k lékům. Z čeledi Enterobacterales jsou Escherichia coli a Klebsiella spp. často izolovanými organismy, které mají pozoruhodné vlastnosti rezistence k léčivům. Proti těmto resekabilním kmenům se běžně předepisují β-laktamy, které samy o sobě tvoří přibližně dvě třetiny klinických receptů z poslední doby.1 Tato skupina obsahuje čtyři hlavní chemické třídy: peniciliny, cefalosporiny, karbapenemy a monobaktamy, z nichž karbapenemy se používají jako léky poslední instance v empirické terapii proti patogenním kmenům grampozitivních, gramnegativních a anaerobních bakterií.2

Rezistence vůči β-laktamům je způsobena produkcí β-laktamáz, tedy hydrolytických enzymů, které jsou schopny inaktivovat antibiotika dříve, než se dostanou k proteinům vázajícím penicilin (PBP) umístěným na cytoplazmatické membráně.3 Mezi hlavní rodiny β-laktamáz patří plazmidem zprostředkované β-laktamázy s rozšířeným spektrem (ESBL), AmpC, cefalosporinázy a karbapenemázy. Všechny třídy byly zjištěny celosvětově, přičemž několik z nich se koncentruje v určitých zemích.1

Geny kódující β-laktamázu AmpC se značně rozšířily a jsou široce detekovány v bakteriálních plazmidech. První varianta AmpC kódovaná v plazmidu byla poprvé identifikována v roce 1989 u Klebsiella pneumoniae izolované v Jižní Koreji. Byla pojmenována CMY-1 kvůli fenotypovému znaku spojenému s cefamycinázou a byla notoricky rezistentní k cefoxitinu.4,5 V krátké době bylo zjištěno mnoho rodin plazmidem zprostředkovaných variant AmpC, převážně z izolátů K. pneumoniae a E. coli. Bakterie disponující plazmidem zprostředkovanými genotypy AmpC byly přiřazeny na základě homologie v sekvenci nukleových kyselin a vytvořily větší počet bakteriálních rodů, které působily jako zdroj těchto plazmidů a řady rodin AmpC.6 Dosud byly celosvětově hlášeny následující rodiny AmpC: dvě rodiny β-laktamáz CMY (CMY-1 a CMY-2) izolované z Aeromonas hydrophila a Citrobacter freundii; enzymy typu FOX a MOX izolované z Aeromonas spp.; rodina ACC pocházející z H. alvei; rodina LAT cefalosporináz izolovaná z C. freundii; rodiny MIR a ACT pocházející z Enterobacter spp. a rodina DHA izolovaná z Morganella morganii4,6,7. Většina plazmidově kódovaných genů AmpC se vyskytuje u izolátů E. coli a K. pneumoniae u nozokomiálních infekcí, zatímco rezistence u ostatních gramnegativních bakterií, jako jsou E. cloacae, C. freundii, S. marcescens a M. morganii, je dána chromozomálně zprostředkovanými β-laktamázami AmpC, což zvyšuje rezistenci k širokospektrým cefalosporinům.8 Organismy produkující ESBL, které se často vyznačují koexpresí s AmpC β-laktamázami, představují vážnou hrozbu při diagnostice a léčbě patogenů.

Geny pro AmpC β-laktamázy, zejména MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM a ACCM, jsou navíc zodpovědné za rozvoj širokospektré rezistence vůči většině β-laktamů (kromě cefepimu a karbapenemů). Získání těchto genů u bakterií může navíc rezistenci dále zvýšit, protože inhibitory enzymů třídy A (včetně kyseliny klavulanové, sulbaktamu a tazobaktamu) a p-chlormerkuribenzoát nejsou proti AmpC β-laktamázám účinné, i když některé z nich mohou být inhibovány tazobaktamem nebo sulbaktamem.6

Přestože je vyvíjeno úsilí o omezení růstu a šíření patogenů rezistentních vůči léčivům, studie týkající se AmpC β-laktamáz v prostředí s omezenými zdroji jsou stále nedostatečné. Nejdůležitějším krokem při zvládání rostoucí antimikrobiální rezistence (AMR) je přesná detekce patogenních (a/nebo rezistentních) kmenů v diagnostických laboratořích. Nicméně laboratorní protokoly pro rutinní hlášení nenabízejí v Nepálu přesný výsledek, protože AmpC β-laktamázy je obtížné identifikovat pouze fenotypovými testy a v klinických laboratořích jsou často falešně detekovány jako ESBL. Izoláty Enterobacterales, které jsou pozitivní ve screeningovém testu fenotypu ESBL, ale negativní při konfirmačním testu, jsou obvykle považovány za potenciální producenty AmpC β-laktamáz, a to buď v důsledku chromozomální deprese, nebo přenosu plasmidů.9

Až odborní kliničtí mikrobiologové nedokáží identifikovat AmpC β-laktamázy zprostředkované plasmidy, což naznačuje potřebu přesnější a specifičtější metody pro rychlou detekci. Některé z těchto postupů jsou však náročné na zdroje a často vyžadují činidla, která nejsou snadno dostupná.10 Z těchto důvodů zůstávají AmpC β-laktamázy v klinických vzorcích nedetekovány. Proto byl navržen spolehlivější a platnější laboratorní protokol sestávající z multiplexní polymerázové řetězové reakce (PCR), který usnadňuje diagnostiku AmpC genů kódovaných v plazmidech, jež jsou zodpovědné za expresi AmpC β-laktamáz u různých klinických infekcí.11

Většina studií se zaměřuje na prevalenci enzymů ESBL u gramnegativních klinických izolátů v Nepálu.12-16 Studií o enzymech AmpC β-laktamáz u gramnegativních bakterií v Nepálu je omezený počet. Jedna studie provedená v údolí Káthmándú uvádí 27,8 % izolátů Enterobacterales jako producenty AmpC β-laktamáz pomocí fenotypové metody.17 Podle našich znalostí existuje v Nepálu omezené množství studií týkajících se detekce a charakterizace enzymů AmpC β-laktamáz u gramnegativních bakterií pomocí fenotypové i genotypové metody. Je nezbytné zavést standardní fenotypové a genotypové metody testování citlivosti na antibiotika pro screening patogenů rezistentních na léčiva v nemocnicích. Tato studie byla provedena za účelem izolace a identifikace genů pro AmpC β-laktamázy (blaCITM a blaDHAM) u gramnegativních bakteriálních izolátů pomocí fenotypového screeningu i konfirmačních metod.

Metody

Design studie

Jedná se o nemocniční průřezovou studii provedenou od června 2017 do ledna 2018 v Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Celkem bylo shromážděno 1151 neduplikovaných klinických vzorků, které byly zpracovány během období studie. Vzorky zahrnovaly moč (n=412), krev (n=206), špičku katétru (n=163), hnis (n=132), stolici (n=89), CSF (n=53), stěr z rány (n=58) a vaginální stěr (n=38). Vzorky byly získány do sterilní, dobře označené a nepropustné nádoby; a zpracovány co nejdříve.18 Do studie byli zařazeni všichni navštěvující pacienti s podezřením na bakteriální infekce, kteří poskytli souhlas se zapojením do studie. Účastníci studie s nedostatečnými demografickými údaji byli vyloučeni.

Kultivace vzorků a identifikace izolátů

Vzorky byly odebrány podle standardních mikrobiologických pokynů pro odběr moči, stolice, hnisu, krve, mozkomíšního moku a špičky katétru. Způsobilé vzorky byly dále očkovány na krevní agar (BA), čokoládový agar (CA) a MacConkeyho agar (MA). Vzorky moči byly navíc naočkovány na chromogenní UTI agar. Izoláty byly identifikovány pomocí standardních mikrobiologických parametrů, jako je morfologický vzhled kolonií, barvicí reakce a biochemické vlastnosti.19,20

Testování citlivosti na antibiotika

Všechny identifikované gramnegativní izoláty byly dále podrobeny testu citlivosti na antimikrobiální látky in vitro pomocí modifikované Kirby-Bauerovy diskové difuzní metody.21 Nejprve byla vytvořena inokula přenesením bakteriálních kolonií z živného agaru do sterilního fyziologického roztoku. Zákal inokula byl stanoven jako ekvivalent 0,5 McFarlandova standardu podle pokynů CLSI. Kobercová kultura testovacích inokulí byla rovněž připravena na Muller-Hintonově agaru (MHA). K testování byly použity antibiotické disky (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, Indie) byly použity v následujícím poměru: amoxicilin (10 μg), azithromycin (10 μg), amikacin (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitin (30 μg), ceftazidim (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), imipenem (10 μg), piperacilin/tazobaktam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), kotrimoxazol (25 μg) a cefepim (30 μg). Naočkovaná destička byla aerobně inkubována při 37 °C až 18 hodin. Po dostatečné inkubaci byly změřeny inhibiční zóny (ZOI) kolem disků a výsledek byl klasifikován jako citlivý, střední nebo rezistentní.21 Izoláty vykazující rezistenci ke třem nebo více antibiotikům různých tříd byly interpretovány jako multirezistentní.22

Screening na AmpC β-laktamázy

Izoláty byly nejprve vyšetřeny na možnou produkci AmpC β-laktamáz podle pokynů CLSI, 2019.23 Pro screening byl v testech AST použit ceftazidim nebo cefotaxim nebo cefoxitin nebo ceftriaxon, každý v množství 30 µg, a organismy rezistentní k těmto antibiotikům (vykazující inhibiční zónu o průměru ≤ 18 mm) byly prověřeny jako potenciální producenti AmpC a podstoupily další konfirmační testy.

Potvrzení pro AmpC β-laktamázy

Screening pozitivních producentů AmpC β-laktamáz byl potvrzen diskovým testem AmpC a konfirmačním testem na bázi inhibitorů (test s kyselinou boronovou).

Při testu s kyselinou boronovou byla kobercová kultura testovaného organismu provedena na MHA desce s použitím 0,5 McFarlandova roztoku. Dva disky cefoxitinu (30 µg), z nichž jeden byl přidán s kyselinou fenylborovou (400 µg), byly umístěny na kobercovou kulturu na MHA desce a inkubovány a výsledky byly interpretovány. Pokud došlo ke zvětšení inhibiční zóny o ≥ 5 mm, když byl hodnocen požadovaný disk s antibiotikem (ceftazidim nebo cefotaxim) v kombinaci s kyselinou fenylboritou než při testu bez kombinace (disk se samotným antibiotikem), byl izolát označen jako s pozitivním konfirmačním testem.

Při testu sbližování disků byly disky položeny na kobercovou kulturu E. coli ATCC 25922. Do středu destičky byl umístěn disk s 30 μg ceftazidimu, následovaný disky s 10 μg imipenemu, 30 μg cefoxitinu a 20/10 μg amoxicilinu/klavulanátu, které byly umístěny ve vzdálenosti 20 mm od disku s ceftazidimem. Kolonie testovaného organismu byly přidány na disk a poté byla destička převrácena a inkubována 24 hodin při 37 °C v aerobním prostředí. Jakékoli odsazení nebo zploštění ZOI znamenalo produkci AmpC β-laktamázy izoláty.20,24

Konzervace izolátů pozitivních na AmpC β-laktamázu

Pro konzervaci byla použita metoda přípravy zásob glycerolu. Organismy byly konzervovány v tryptickém sójovém bujónu (TSB) obsahujícím 40 % glycerolu a uchovávány při -20 °C.25

Extrakce surové plazmidové DNA

Oddělená kolonie testovaného organismu byla naočkována do bujónu Luria Bertani (LB). Inokulum bylo inkubováno aerobně pomocí třepačky ve vodní lázni při 37 °C po dobu 18-24 hodin. Takto získaná čistá kultura byla podrobena metodě alkalické lýzy za účelem extrakce plasmidové DNA. Extrahovaná plasmidová DNA byla poté suspendována v TE pufru a uložena při -20 °C až do dalšího zkoumání.26

Amplifikace genů β-laktamáz AmpC (blaCITM a blaDHAM) pomocí PCR

Geny β-laktamáz AmpC (blaCITM a blaDHAM) byly amplifikovány pomocí PCR s použitím preparátu plasmidové DNA jako templátu. Pro gen blaCITM byly použity primery CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) a CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) jako přímý a reverzní primer, zatímco primery pro gen blaDHAM byly přímá sekvence DHAM pro (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) a reverzní sekvence DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 Objem reakce byl nastaven na 25 µl přidáním 12,5 µl 1X master mixu (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonsko), po 0,5 µl přímého a reverzního primeru a 4 µl DNA templátu a 7,5 µl ddH2O. Optimalizovaná amplifikace PCR obou genů byla 94 ºC po dobu 3 minut pro počáteční denaturaci; 35 cyklů denaturace při 94 ºC po dobu 30 sekund; 25 cyklů žíhání při 62 ºC po dobu 30 sekund; 35 cyklů extenze při 72 ºC po dobu 1 minuty; a závěrečná extenze při 72 ºC po dobu 7 minut.11,27

Purifikace DNA

Plasmidová DNA byla purifikována metodou srážení etanolem. Při této metodě se peleta DNA opláchla ledově studeným 70% ethanolem a nechala se 10 minut zaschnout, což usnadnilo odpaření alkoholu. Pelet DNA byl suspendován v pufrovacím roztoku obsahujícím Tris, EDTA a RNázy, aby se vymyly zbývající nečistoty.

Detekce produktů PCR pomocí gelové elektroforézy

Amplifikované produkty byly vizualizovány pomocí gelové elektroforézy v 1,5% agarózovém gelu obarveném 0,1 µl ethidium bromidu. Po přípravě gelu byly do první jamky přidány 2 µl 100bp DNA ladderu jako markeru, do další jamky 2 µl negativní kontroly, do další jamky 2 µl pozitivní kontroly a do zbývajících jamek 2 µl PCR produktů. Nakonec byl gel vizualizován pod UV transiluminátorem.28

Kontrola kvality

Pro postupy v této studii byl přijat standardní aseptický postup. Všechny šarže kultivačních médií a chemických činidel byly zpracovány aseptickými technikami podle pokynů CLSI. V AST byla kontrola kvality udržována pomocí kontrolních kmenů E. coli ATCC 25922. Při PCR byla kontrola kvality zajištěna použitím izolátů Klebsiella nesoucích oba sledované geny, zatímco slepé nebo negativní kontroly byly připraveny bez použití nukleových kyselin. Všechny tyto kontroly byly použity v každé dávce PCR testu.

Statistická analýza

Data byla zadána a analyzována pomocí softwaru SPSS verze 24.0. Data byla vyhodnocena na základě výsledků PCR testu. Asociace byly zkoumány pomocí chí-kvadrát testů při 95% intervalu spolehlivosti (CI) mezi demografickými proměnnými, jako je pohlaví a věk subjektů.

Výsledky

Demografická a klinická charakteristika zařazených pacientů

Mezi 1151 zařazenými pacienty bylo 54,2 % (624/1151) mužů a 45,8 % (527/1151) žen. Z 253 bakteriálních nárůstů pocházelo 47,8 % (121/253) od mužů a 52,2 % (132/253) od žen. Z celkového počtu (253) bakteriálních nárůstů pocházelo 26,1 % (66/253) ze vzorků moči, následovaly špičky katétrů (17,4 %;44/253), krev (16,2 %; 41/253), hnis (11,9 %; 30/253) a stěry z ran (10,7 %; 27/253). Pokud jde o rozdělení pacientů podle věku, nejvyšší nárůst bakteriálních patogenů byl zjištěn ve věkové skupině 16-45 let (39,5 %; 100/253), následované skupinami 46-60 let (30,1 %; 76/253), >60 let (24,1 %; 61/253) a 0-15 let (6,3 %; 16/253) (tabulka 1).

Tabulka 1 Demografická a klinická charakteristika pacientů navštěvujících Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Distribuce bakteriálních izolátů v klinických vzorcích

Z celkového počtu 1151 klinických vzorků, 22 % (253/1151) vykazovalo růst na kultivačních médiích. Z 253 bakteriálních izolátů byla většina (89,3 %; 226/253) gramnegativních bakterií. Mezi rostoucími bakteriemi převládala E. coli (28,5 %; 72/253), následovaná Pseudomonas aeruginosa (16,2 %; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8 %; 40/253), grampozitivními bakteriemi (10,7 %; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9 %; 25/253) a Klebsiella oxytoca (4 %).7 %; 12/253) (Obrázek 1)

Obrázek 1 Rozložení bakteriálních rodů v kultivačně pozitivních klinických vzorcích (n=253).

Vzorce citlivosti izolovaných gramnegativních bakterií na antibiotika

Z 226 gramnegativních bakteriálních izolátů bylo 66 izolátů.8 % (151/226) bylo zjištěno, že jsou rezistentní k cefoxitinu, dále k ceftazidimu (58,4 %; 132/226), ciprofloxacinu (53,5 %; 121/226) a cefepimu (51.8 %; 117/226), zatímco izoláty byly nejcitlivější na meropenem (69 %; 156/226), ertapenem (68,6 %;155/226), imipenem (66,8 %; 151/226), amikacin (61,1 %;138/226), piperacilin/tazobaktam (56,6 %;128/226) a azitromycin (53.1 %; 120/226) (tabulka 2).

Tabulka 2 Vzor citlivosti gramnegativních bakteriálních izolátů k antibiotikům (n=226)

Vzor citlivosti izolátů k více léčivům (MDR)

Z 226 izolátů bylo 46.9 % (106/226) izolátů bylo MDR. Nejvyšší procento MDR bylo zjištěno u E. coli (31,1 %; 33/106), následované P. aeruginosa (20,8 %; 22/106), A. baumannii (18,9 %; 20/106), K. pneumoniae (9,4 %; 10/106) a K. oxytoca (4,7 %; 5/106) (obrázek 2). U jednotlivých druhů bylo zjištěno nejvyšší procento multirezistence u C. freundii (100 %; 8/8), následované P. aeruginosa (53,6 % 22/41), C. koseri (50 %; 2/4), A. baumannii (50 %; 20/40) a E. coli (45,8 % 33/72), v uvedeném pořadí (obrázek 2).

Obrázek 2 Rozložení MDR bakterií a celkové % MDR a MDR v rámci jednotlivých druhů.

Detekce ampC různými testy

Z 226 gramnegativních izolátů vykazovalo 50 % (113/226) rezistenci vůči cefoxitinu. Izoláty produkující β-laktamázu AmpC byly potvrzeny dvěma různými konfirmačními testy, diskovými testy a testy s kyselinou boronovou. Z devadesáti jedna izolátů vykazovalo 91,2 % (83/91) pozitivní výsledek v obou testech a 8,8 % (8/91) izolátů vykazovalo pozitivitu pouze v testu s kyselinou boronovou potvrzenou alespoň jedním testem a byly považovány za producenty AmpC β-laktamázy.

Prevalence genů blaCITM a blaDHAM u gramnegativních izolátů produkujících AmpC β-laktamázu

V testu PCR bylo 90,1 % (82/91) a 87,91 % (80/91) izolátů pozitivních na blaCITM a blaDHAM. Respektive byly zjištěny amplifikované geny blaCITM a blaDHAM s velikostí jejich amplikonu 465bp a 405bp (obr. 3 a 4).

Obr. 3 Elektroforéza v agarózovém gelu (1,5 %) použitá pro separaci produktů PCR. Pruh 2, pozitivní kontrola; pruhy 3, 5 a 7 jsou CITM pozitivní; pruhy 4 a 6, CITM negativní; a pruh 8. negativní kontrola.

Obrázek 4 Elektroforéza v agarózovém gelu (1,5 %) použitá pro oddělení produktů PCR. Pruh 2, pozitivní kontrola; pruhy 3, 4, 6 a 7 jsou Dham pozitivní; pruh 5, Dham negativní; a pruh 8, negativní kontrola.

Distribuce genů AmpC β-laktamázy, blaCITM a blaDHAM mezi gramnegativními izoláty a jejich vztah k pohlaví, věku, klinickým vzorkům a klinickým izolátům

Z 91 producentů AmpC bylo 50,6 % (46/91) izolátů od žen a 49,4 % (45/91) od mužů. Podobně stejné procento (50 %; 41/82) genů blaCITM bylo získáno od vzorků obou pohlaví, zatímco 51,3 % (41/80) a 48,7 % (39/80) genů blaDHAM bylo zjištěno u vzorků získaných od pacientů mužského a ženského pohlaví. Nebyla zjištěna žádná významná souvislost pohlaví pacienta s produkcí enzymů AmpC a genů AmpC (tabulka 3).

Tabulka 3 Distribuce genů AmpC β-laktamázy, CITM a DHAM mezi izoláty gramnegativních bakterií a jejich vztah k pohlaví, věku a klinickým vzorkům

Nejvyšší počet producentů AmpC β-laktamázy (40.7 %; 37/91) a prevalence izolátů produkujících blaCITM (40,2 %; 33/82) a blaDHAM (41,2 %; 33/80) byly získány z věkové skupiny (46-60) let, následované (16-45) let (30,8 %; 28/91), (29,3 %;24/82) a 31,3 %; 25/80) v uvedeném pořadí. Byla zjištěna významná souvislost mezi produkcí enzymu AmpC β-laktamázy a věkovou skupinou (p=0,01), zatímco ostatní faktory včetně získání genů blaCITM a blaDHAM neměly významnou souvislost s věkem pacientů (tabulka 3).

Mezi klinickými vzorky byl nejvyšší počet izolátů produkujících AmpC β-laktamázu (20,9 %; 19/91) zjištěn z krve a špiček katétrů, následovala moč (18,7 %; 17/91), hnis (13,3 %; 12/91) a stěry z ran (9,9 %; 9/91). Podobně nejvyšší počet izolátů produkujících blaCITM a blaDHAM byl zjištěn ze špiček katétrů (21,9 %; 18/82); (22,5 %; 18/80), následovala krev (19,5 %; 16/82); (21,3 %; 17/80) moč (17,0 %; 14/82); (17,5 %; 14/80) a hnis (13,4 %; 11/82); (8,8 %; 7/80). Nebyla zjištěna významná souvislost mezi klinickými vzorky, produkcí AmpC β-laktamázy a geny: blaCITM a blaDHAM (tabulka 3).

Distribuce AmpC β-laktamáz a získání genů blaCITM a blaDHAM u různých gramnegativních bakterií

Nejvyšší prevalence enzymů AmpC β-laktamáz byla zjištěna u E. coli (28,6 %; 26/91), následovaná P. aeruginosa (26,4 %; 24/91), A. baumannii (13,2 %; 12/91) a K. pneumoniae (10,9 %; 10/91). Nejvyšší prevalence genů blaCITM a blaDHAM byla zjištěna u E. coli (30,6 %; 25/82) (31,3 %; 25/80), následované P. aeruginosa (25,7 %; 21/82), (22,5 %; 18/80) A. baumannii (12,2 %; 10/82), (12,4 %; 10/80) a K. pneumoniae (10,9 %; 9/82), (12,4 %; 10/80) (tab. 3).

Diskuse

Zvyšující se výskyt antimikrobiální rezistence zůstává jedním z hlavních problémů veřejného zdraví v rozvojových zemích, jako je Nepál29 , což vede k prodloužení hospitalizace, zvýšení nákladů na léčbu, omezení terapeutických možností a zvýšení morbidity a mortality.29,30 Produkce β-laktamáz je hlavním obranným mechanismem proti β-laktamovým antibiotikům. Tato studie byla provedena s cílem prozkoumat přítomnost β-laktamáz třídy C Amber (AmpC) u gramnegativních organismů získaných z klinických vzorků v ANIAS, Kathmandu, Nepál. Tato studie dále hodnotila prevalenci genů β-laktamáz AmpC (blaCITM a blaDHAM) pomocí PCR testu. Zjistili jsme vysokou prevalenci těchto enzymů a genů, i když se prevalence těchto enzymů lišila v různých zeměpisných oblastech, v rámci jednotlivých zemí i mezi nimi.

Z 1151 klinických vzorků vykazovalo významný růst organismů pouze 253 (21,9 %). Z celkového počtu (253) bakteriálních nárůstů tvořily více než devadesát procent gramnegativní bakterie, mezi nimiž převažovaly izoláty E. coli. Naše zjištění jsou v souladu s předchozími studiemi hlášenými z Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, Indie,36 Al-Najaf City, Irák,37 Shashemene Referral Hospital, Etiopie,38 a Mexico City, Mexiko.39 Mírně vyšší výskyt gramnegativních bakteriálních infekcí byl pozorován u pacientek a mohl být způsoben vyšší prevalencí infekcí močových cest u žen. To je v souladu s předchozími studiemi z Model Hospital, Kathmandu17 a Andra-Pradesh, Indie.40 V souladu s touto studií byla z jedné studie provedené ve státě Uttar Pradesh v Indii hlášena vyšší míra hnisavých infekcí u pooperačních případů u žen (63,33 %) než u mužů (43,75 %).41

V této studii vykazovaly gramnegativní bakteriální izoláty vyšší rezistenci k těmto antibiotikům: cefoxitin, ceftazidim, ciprofloxacin a cefepim, následovaný kotrimoxazolem, zatímco jako nejcitlivější antibiotika byly zaznamenány meropenem, imipenem, piperacilin-tazobaktam a azitromycin. Srovnatelný vzorec byl pozorován v některých předchozích nálezech z Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara.43 Cefoxitin a ceftazidim s nízkou citlivostí jsou léky první linie, které jsou snadno hydrolyzovány bakteriálními enzymy a jsou méně užitečné při léčbě infekcí způsobených gramnegativními patogeny. Podobně jako v naší studii byly imipenem/meropenem shledány jako nejcitlivější léky v předchozích studiích z Modelové nemocnice v Káthmándú,17 španělského Madridu44 a Wisconsinu v USA.45

Antimikrobiální rezistence (AMR) s rostoucím šířením MDR je celosvětovým problémem a její dopady jsou vyšší v zemích s nízkými a středními příjmy, kde je zátěž infekčními chorobami vysoká.30 Léčba MDR mikrobů je nákladná a obtížná a je dále umocněna vysokou prevalencí nozokomiálních infekcí.46 V této studii byla téměř polovina izolovaných gramnegativních izolátů (46,9 %; 106/226) označena jako MDR. Vyšší prevalence MDR bakterií byla zaznamenána z některých dalších studií provedených v Káthmándú46-49 a dalších okresech Nepálu.15,50,51 Důvodem snížené citlivosti vůči antibiotikům novější generace může být produkce ESBL, metallo β-laktamázy (MBL) nebo AmpC β-laktamázy.52 K multirezistenci navíc dochází v důsledku agregace a exprese různých genů na rezistentních (R) plazmidech nebo genů, které kódují multidrug efflux pumpy.53 Kromě toho jsou geny zodpovědné za expresi enzymů β-laktamáz neustále spojovány s neβ-laktamovými antibiotiky, jako jsou aminoglykosidy a fluorochinolony.

V této studii byla zjištěna vyšší produkce AmpC u mužů (41,67 %) než u žen (38,98 %). Výsledky této studie jsou v souladu s některými dalšími studiemi z Kana v severozápadní Nigérii.54 Naše výsledky se však lišily od studií hlášených z Beninu v Nigérii.55 Vyšší výskyt UTI s multirezistencí u žen byl zaznamenán v mnoha studiích, což může být způsobeno vyšším výskytem patogenů produkujících AmpC u žen, protože jsou náchylnější k UTI než muži.

Použití cefoxitinové rezistence v diagnostických laboratořích slouží jako spolehlivý screeningový prostředek/značka k detekci produkce AmpC. Tento marker navíc poskytuje dobrou negativní prediktivní hodnotu.

Navzdory svému širokému záběru některé studie zdůrazňují použití cefoxitinu jako špatného screeningového prostředku pro produkci AmpC. Důvodem může být existence jiných alternativních mechanismů než AmpC (jedním z nich je mutace porinového kanálu), které mohou vést k falešně pozitivní interpretaci (jako rezistence k cefoxitinu).52 Naše studie odhalila, že třetina gramnegativních izolátů (>40 %) byla zodpovědná za produkci AmpC. Výsledky této studie kontrastovaly se studií z Modelové nemocnice v Káthmándú.17 Rozdíl může být způsoben fenotypovou metodou detekce použitou v této studii, která používala test rezistence na cefoxitin a diskovou metodu testování AmpC pomocí cefoxitinu (30 µg). Jako konfirmační test byl použit test na kyselinu fenylboronovou s použitím cefoxitinu 30µg/400µg kyseliny fenylboronové. Bylo prokázáno, že deriváty kyseliny boronové jsou reverzibilními inhibitory enzymů β-laktamázy AmpC.56

V této studii byla produkce AmpC pozorována u 91 (80,53 %) izolátů ze 113 izolátů. Míra produkce AmpC v naší studii je o něco vyšší než v jiných studiích hlášených z Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan58 a Indie.59

K vyrovnání omezení způsobených jednou z metod může integrace obou technik do rutinní diagnostiky zvýšit citlivost a specifičnost testů v klinických podmínkách.

Celkem 73 gramnegativních izolátů vykazovalo přítomnost genů blaCITM i blaDHAM. Tato zjištění jsou v souladu s předchozí studií hlášenou z Ilamu v Íránu.27 V podobném typu studie hlášené z Indie se ukázalo, že geny blaCITM byly častější u E. coli.60 V naší studii byla prevalence genů spojených s AmpC (blaCITM a blaDHAM) zkoumána fenotypovými a genotypovými metodami. Tato studie poskytuje širokou analýzu gramnegativních bakterií spojených s produkcí β-laktamázy AmpC a vzorců jejich citlivosti na antibiotika mezi klinickými izoláty. Výsledky této studie jsou důležité pro získání informací o vzorcích rezistence různých organismů vůči cefalosporinům. Sledování multirezistence s β-laktamázou včetně produkce ESBL, MBL a AmpC je potřebné pro běžnou klinickou praxi, aby bylo možné optimalizovat léčbu a předcházet další rezistenci u β-laktamových antibiotik.13,61,62

Silné stránky a omezení

Jedná se o první studii zkoumající geny β-laktamázy AmpC (blaCITM a blaDHAM) pomocí fenotypového i molekulárního testu mezi pacienty navštěvujícími terciární zdravotnické centrum v Nepálu. Výsledky této studie mohou být podkladem pro antimikrobiální politiku center terciární péče, včetně přípravy managementu nemocničních infekcí, léčebného protokolu a diagnostického postupu. Tato studie má několik omezení, mezi něž patří vyšetřování omezeného počtu AmpC β-laktamáz, krátké trvání studie a provedení v jediném centru terciární péče. Budoucí studie na ni mohou navázat a provést longitudinální studii ve více centrech terciární péče se zkoumáním všech β-laktamáz, jako jsou ESBL, MBL, KPC, a hlavních genů zodpovědných za rezistenci. Nicméně jako první studie svého druhu, která trianguluje fenotypové a molekulární metody, bude tato studie cennou referencí pro budoucí studie o β-laktamázách AmpC a prevalenci genů blaCITM a blaDHAM v jiných prostředích/nemocnicích Nepálu.

Závěr

Naše zjištění ukazují, že snížená citlivost k cefoxitinu u gramnegativních izolátů souvisí s přítomností plazmidově zprostředkovaných genů AmpC. Protože neexistuje jediná definitivní metoda, navrhuje se pro přesnou detekci bakterií produkujících AmpC β-laktamázu použít několik fenotypových detekčních metod současně. V této studii PCR detekovala téměř 90 % genů pro AmpC β-laktamázu (blaCITM a blaDHAM) mezi fenotypově potvrzenými izoláty. Vysoká prevalence rezistentních genů a MDR mezi gramnegativními izoláty je alarmující známkou, která vyžaduje naléhavá intervenční opatření k omezení růstu a šíření těchto izolátů.

.