Přístupnost a architektura chromatinu

Obrázek 3: Techniky konformace chromozomů. Různé kroky 3C, 4C, 5C, ChIA-PET a Hi-C.

Zachycení konformace chromatinu (3C)

3C využívá zesíťování formaldehydem k uzamčení trojrozměrné struktury chromatinu na místě, po kterém následuje štěpení restrikčními enzymy. Vyříznuté fragmenty DNA se poté analyzují pomocí qPCR a sekvenování, aby se zjistilo, kde jsou vzdálené oblasti DNA propojeny. Tento přístup k analýze 3D struktury chromatinu a interakcí in vivo byl poprvé vyvinut v roce 2002 (Dekker et al., 2002) a od té doby se stal základem pro řadu příbuzných technik, které byly vyvinuty za účelem dosažení většího rozsahu, výkonnosti nebo specifičnosti.

Cirkulární zachycení konformace chromozomu (4C)

4C umožňuje identifikovat dosud neznámé oblasti DNA, které interagují se zájmovým lokusem, což činí 4C ideální pro objevování nových interakcí v rámci specifické oblasti (Dekker et al.),

4C užitečné rady:

• Vyberte správné restrikční enzymy. Pro lokální interakce mezi zájmovou oblastí a blízkými sekvencemi na stejném chromozomu jsou vhodnější častěji se vyskytující řezáky (tj. místa pro rozpoznání čtyř bp) (van der Werken et al., 2012).
• Optimalizujte síťování. Nižší koncentrace formaldehydu podporují nežádoucí samovazby zájmové oblasti, ale také zabraňují vzniku „chomáčků“ DNA, které brání řezání restrikčním enzymem. Vysoké koncentrace formaldehydu snižují počet samo-vázání, ale zvyšují počet „vlásenek“. Optimální koncentrace formaldehydu by měla být zvolena pro konkrétní experimentální situaci, aby se tyto aspekty vyvážily. Ošetření 1 % formaldehydu po dobu 10 min je dobrým výchozím bodem pro většinu experimentů (van der Werken a kol., 2012).

Zachycení konformace chromozomů kopií uhlíku (5C)

5C vytváří knihovnu všech produktů ligace z oblastí DNA, které se spojují s cílovými lokusy, které se poté analyzují pomocí NGS. Metoda 5C je ideální v případech, kdy je zapotřebí velký detail o všech interakcích v dané oblasti, například při tvorbě diagramu podrobné interakční matice určitého chromozomu. Metoda 5C však není skutečně celogenomová, protože každý primer 5C musí být navržen individuálně, takže se nejlépe hodí pro konkrétní oblasti (Dotsie a Dekker, 2007).

5C užitečné rady:

• Vyberte správný restrikční enzym. Výběr enzymu, který účinně funguje za vašich specifických experimentálních podmínek, je zásadní. Například BamHI se pro většinu experimentů nedoporučuje kvůli neúčinnosti v podmínkách 3C (Dotsie et al., 2007).
• Optimalizujte návrh primerů. 5C používá dva primery: přední 5C primer, který se váže před místem ligace, a reverzní primer, který se váže bezprostředně za ním. Délka primerů by měla být nastavena tak, aby teplota žíhání byla přibližně 65 °C, což umožní přesné žíhání primerů s jejich restrikčními fragmenty. Zajistěte, aby byly primery 5C syntetizovány s fosfátem na 5′ konci pro ligování.
• Použijte kontrolní templát. Tím se kontrolují rozdíly v účinnosti primerů. Doporučuje se kontrolní knihovna sestavená z celé studované genomové oblasti. Pokud tato knihovna není zkonstruována, měli by si výzkumníci uvědomit, že frekvence interakcí budou méně přesné.

Chromatinová interakční analýza pomocí sekvenování párových konců značek (ChIA-PET)

ChIA-PET využívá aspekty ChIP a 3C k analýze vzájemného působení vzdálených oblastí DNA prostřednictvím určitého proteinu.

ChIA-PET se nejlépe používá pro objevné experimenty zahrnující protein zájmu a neznámé vazebné cíle DNA. Například vazebná místa transkripčních faktorů se nejlépe studují pomocí ChIA-PET, protože tato technika vyžaduje, aby byla DNA vázána transkripčním faktorem in vivo, aby byla interakce vyvolána (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET užitečné rady:

• Překrývání značek PET pro snížení pozadí. Stejně jako u většiny technologií 3C je šum pozadí technickou výzvou. Zejména u ChIA-PET může šum ztížit nalezení interakcí dlouhého dosahu se zájmovým lokusem. Užitečným tipem k překonání tohoto problému je požadavek, aby se značky PET překrývaly na obou koncích oblasti, aby se jednalo o interakci na dlouhou vzdálenost.

ChIP-smyčka

ChIP-smyčka je směs ChIP a 3C, která využívá protilátky cílené na proteiny podezřelé z vazby na zájmovou oblast DNA. ChIP-loop je ideální ke zjištění, zda dvě známé oblasti DNA interagují prostřednictvím zájmového proteinu. ChIP-loop se také dobře hodí k potvrzení podezřelých interakcí, ale ne k objevení nových interakcí (Horike et al., 2005).

ChIP-loop užitečné rady:

• Vyhněte se nenativním smyčkám. Největším problémem, se kterým se u ChIP-smyček setkáváme, je tvorba nenativních smyček vznikajících během koncentrace DNA předtím, než dojde k ligaci. Jednoduchým způsobem, jak se tomu vyhnout, je zvolit protokol, který provádí srážení až po kroku ligace (Simons et al., 2007).
• Ověřte interakce ChIP-smyčky. Dalším problémem při ChIP-smyčce může být přesná kvantifikace produktů ligace. Technologie 3C, zejména ChIP-smyčka, často zachycují náhodné interakce. Chcete-li s tímto problémem bojovat, zvažte provedení paralelního experimentu ChIP a jeho použití k validaci interakcí ChIP-smyčka. Pokud je interakce DNA-protein-DNA identifikovaná pomocí ChIP-smyčky skutečně skutečná, pak by se obě interakce DNA-protein měly objevit také v datech ChIP (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifikuje ligační produkty z celého genomu a hodnotí jejich četnost pomocí vysokokapacitního sekvenování. Hi-C je skvělou volbou, pokud je požadováno široké pokrytí celého genomu a na rozlišení příliš nezáleží, například při mapování celogenomových změn ve struktuře chromozomů v nádorových buňkách (Lieberman-Aiden et al., 2009).

Užitečné rady pro Hi-C:

• Optimalizujte amplifikaci knihovny. Amplifikace knihovny Hi-C musí generovat dostatečné množství produktu pro analýzu a zároveň se vyhnout artefaktům PCR. K tomu je třeba optimalizovat počet cyklů PCR (v rozmezí 9-15 cyklů). Pokud nelze vytvořit dostatek produktu (50 ng DNA), mělo by se spíše než zvyšovat počet cyklů spojit více reakcí PCR, obvykle stačí pět reakcí (Belton et al., 2012).
• Vyvážit délky čtení. Stejně jako u každého sekvenčního experimentu je nejdůležitější kvalitní čtení. Délka čtení musí být optimální, aby byla vyvážena potřeba dlouhých čtení pro mapování interakcí, ale ne příliš dlouhých, aby neprošla přes ligační spoj do partnerského fragmentu. Proto jsou ve většině případů optimální 50 bp čtení (Belton et al., 2012).
• Zvolte vhodnou velikost binů. To je rozhodující pro analýzu dat. Velikost binů by měla být nepřímo úměrná počtu očekávaných interakcí v oblasti. Použijte menší bin pro častější intrachromozomální interakce a větší bin pro méně časté interchromozomální interakce (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C používá kombinaci 3C a technologie zachycení oligonukleotidů (OCT) spolu s vysoce výkonným sekvenováním ke studiu stovek lokusů najednou. Capture-C je ideální v případech, kdy je požadováno vysoké rozlišení i rozsah celého genomu. Například při analýze funkčního vlivu každého SNP v genomu souvisejícího s onemocněním na lokální strukturu chromatinu (Hughes et al., 2014).

Užitečné rady pro Capture-C:

• Pečlivě vybírejte pozice sond. Nejlepší je umístit sondy blízko míst restrikčních enzymů, a pokud možno je i překrývat (Hughes et al., 2014).
• Udržujte knihovny komplexní. Udržení komplexnosti knihovny je nejvyšší prioritou. Komplexní knihovna znamená více kvalitních interakcí ve výstupu. Z tohoto důvodu je třeba se vyhnout všemu, co by mohlo snížit komplexnost knihovny, například zachycení biotinu Hi-C (Hughes et al., 2014).
• Dávejte pozor na falešné interakce v duplikovaných oblastech. Proces mapování může stimulovat silné interakce mezi těmito oblastmi (například pseudogeny), které jsou ve skutečnosti artefakty (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y a Dekker J (2012). Hi-C: komplexní technika pro zachycení konformace genomů. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M a Kleckner N (2002). Zachycení konformace chromozomů. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). Tři „C“ zachycení konformace chromozomů: kontroly, kontroly, kontroly. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J. a Dekker J. (2007). Mapování sítí fyzických interakcí mezi genomovými elementy pomocí technologie 5C. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y a Dekker J (2007). Technologie zachycení konformace chromozomů pomocí uhlíkových kopií. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF a Kohwi-Shigematsu T (2005). Ztráta tiché chromatinové smyčky a porucha imprintingu DLX5 u Rettova syndromu. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ a další (2009). Lidský chromatinový interaktom vázaný na estrogenový receptor alfa. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Komplexní mapování interakcí dlouhého dosahu odhaluje principy skládání lidského genomu. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (srpen 2014). E-mailový rozhovor.

Hughes JR, et al. (2014). Analýza stovek cis-regulačních krajin s vysokým rozlišením v jediném vysokokapacitním experimentu. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J a de Laat W (2007). Hodnocení metod založených na 3C pro zachycení interakcí DNA. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E a de Laat W (2012). Technologie 4C: protokoly a analýza dat. Methods Enzymol, 513, 89-112

.