Nové aplikace bakteriálních spor v nanobiotechnologiích

Spory se skládají z bílkovin, mají uspořádaná pole protomerních podjednotek, vykazují samosestavování a mají ochranné vlastnosti. Jako spící metabolicky neaktivní formy života mohou spory přežívat neomezeně dlouho ve vyschlém stavu a skutečně bylo zdokumentováno, že přežívají neporušené miliony let . Spory odolávají teplotám až 90 °C i působení škodlivých chemických látek . Většina (ale ne všechny) bakterie tvořící spory patří do dvou hlavních rodů: Bacillus a Clostridium. Klostridia tvořící spory se na rozdíl od rodu Bacillus diferencují pouze za anaerobních podmínek, což z rodu Bacillus činí nejvhodnější rod pro studium.

Druhy rodu Bacillus vytvářejí jedinou spóru nebo endosporu (na rozdíl od houbových exospor), a to uvnitř bakteriální buňky procesem diferenciace, který vyžaduje koordinované působení stovek vývojových genů . Zralé spory jsou obvykle 0,8-1,2 μm dlouhé a mají buď kulovitý, nebo elipsoidní tvar (viz obrázek 1A). Jediný bakteriální chromozom je kondenzován ve středu spory známé jako jádro. Jádro spory obklopují vrstvy lipidové membrány a modifikovaného peptidoglykanu, ale nejdůležitější strukturou je obal spory. Tento vrstevnatý bílkovinný obal poskytuje sporám odolnost vůči organickým rozpouštědlům a lysozymu. U Bacillus subtilis je přítomno až 25 různých proteinů pláště ve dvou odlišných vrstvách pláště (obrázek 1B), vnitřním a vnějším plášti, ale u jiných druhů existují důkazy, že plášť je méně složitý a v některých případech se může skládat pouze z několika typů proteinů . Struktura a sestavení pláště výtrusů se nyní stává modelovým systémem pro pochopení složitých morfogenetických procesů sestavování podobně jako při klasických studiích sestavování fágů T4. Vnější, elektronově hustá vrstva pláště B. subtilis se skládá z 5 hlavních polypeptidů: CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) a CotF (8 kDa). CotA je multikoperoxidáza a může se hromadit v multimerních formách (pozorováno mikroskopicky) ve sporulujících buňkách u některých mutantů s defektním pláštěm . Pravděpodobně oligomerizace a samoskladba CotA předchází ukládání na povrch pláště spór. Bylo také prokázáno, že proteiny CotG a CotB spolu kovalentně interagují a navíc CotG a také CotC mají extrémně neobvyklé aminokyselinové sekvence obsahující několik opakování (>13) 12-13 aminokyselin bohatých na lyziny a tyroziny. Kromě toho má mnoho proteinů spórového pláště neobvyklé profily, tj. multimerní formy a aberantní molekulové hmotnosti, při zkoumání pomocí SDS-PAGE. Nedávno se ukázalo, že obal spór je ve skutečnosti pružný a může se rozpínat a smršťovat a tato vlastnost je rozhodující pro tvorbu spór při dehydrataci spór a podobně pro klíčení při rehydrataci spór . Tento aspekt samosložené struktury je obzvláště zajímavý a mohl by nabídnout řadu budoucích aplikací v oblasti dodávání léčiv, nanovýroby a povrchových povlaků.

Bakteriální endospory. Panel A ukazuje endospory B. subtilis, z nichž jedna je stále zachována uvnitř „mateřské buňky“ ve tvaru tyčinky. U B. subtilis mají spory délku přibližně 1,2 μm a jsou elipsoidní. Uvolněné spory mají průhledný ochranný obal známý jako obal spory a skládá se až z 25 různých protomerních složek sestavených do samostatných vrstev. Panel B ukazuje typickou frakcionaci SDS-PAGE (12,5 %) rozpustných proteinů obalu spór, která odhaluje převládající druhy.

Engineering the Bacterial Spore Coat

Nedávno byla popsána strategie inženýrského vývoje spor Bacillus subtilis tak, aby na povrchu spór zobrazovaly heterologní antigeny, která je znázorněna na obrázku 2. Systém zobrazení založený na spórách poskytuje několik výhod oproti systémům založeným na použití bakteriálních buněk, k nimž patří robustnost bakteriálních spor umožňující skladování ve vyschlé formě, snadná výroba, bezpečnost a technologická platforma podpořená rozsáhlými nástroji pro genetickou manipulaci.

Zobrazení na povrchu spór pomocí proteinů z pláště spór. Spora B. subtilis se skládá z vnitřního jádra (žlutě) obklopeného peptidoglykanovou kůrou (červeně) a bílkovinného pláště rozděleného na vnitřní (šedě) a vnější (černě) část. Na povrchu spory je vystaven fúzní protein složený z nosné (modré) a pasažérské (fialové) části.

Na rozdíl od množství dostupných informací o tom, jak genová exprese řídí diferenciaci rostoucí buňky v dormantní spóru, je málo známo o mechanismech zabudování proteinu do pláště, o povaze strukturních složek tvořících nejzevnější část pláště a o tom, zda existují kotvící motivy. První pokusy o vystavení heterologních proteinů na povrchu spór byly zaměřeny na dvě složky pláště, CotB a CotC. V případě CotB je známo, že tento protein pláště spór je umístěn na povrchu, zatímco v případě CotC má tento druh v porovnání s ostatními proteiny pláště vysokou relativní abundanci . Pozorování, že obě tyto složky pláště jsou nepotřebné pro tvorbu zdánlivě normální spory i pro její klíčení, bylo dalším pozitivním rysem při výběru CotB a CotC jako potenciálních nosných proteinů.

Dva antigeny byly původně vybrány jako modelové proteiny pro zobrazení na povrchu spór: i) netoxický 459 aminokyselinový C-koncový fragment tetanového toxinu (TTFC), dobře charakterizovaný a vysoce imunogenní 51 .8 kDa peptid , kódovaný genem tetC bakterie Clostridium tetani; a ii) 103 aminokyselinová podjednotka B toxinu enterotoxigenních kmenů Escherichia coli (LTB), 12 kDa peptid, kódovaný genem eltB .

CotB jako nosný protein

Stejně jako ostatní složky pláště byl CotB přiřazen k vnější vrstvě pláště na základě genetických důkazů a teprve nedávno imunocytofluorimetrická analýza provedená na neporušených sporách ukázala, že CotB je přístupný pro CotB specifické protilátky, a že je tedy pravděpodobně vystaven na povrchu spor .

Strukturní gen CotB, cotB, je pod dvojí transkripční kontrolou σK a DNA vazebného proteinu GerE. V důsledku toho je cotB přepisován pouze v kompartmentu mateřské buňky sporulující buňky . Jakmile je cotB syntetizován v cytoplazmě mateřské buňky, je sestaven kolem tvořící se spory způsobem, který do jisté míry závisí na CotE, CotG a CotH. Proto CotB a heterologní protein, který je s ním případně spojen, nepodstupují krok translokace buněčné stěny, který je typický pro systémy zobrazení u jiných bakterií.

CotB má silně hydrofilní C-koncovou polovinu tvořenou třemi 27 aminokyselinovými repeticemi bohatými na serinové, lysinové a glutaminové zbytky. Serinové zbytky tvoří více než 50 % C-koncové poloviny CotB. Předpokládá se, že lysinové zbytky v repeticích CotB představují místa vnitromolekulárního nebo mezimolekulárního zesíťování, analogicky k proteinům pojivové tkáně kolagenu a elastinu. Protein CotB má odvozenou molekulovou hmotnost 46 kDa, ale na SDS-PAGE migruje jako polypeptid o hmotnosti 59 kDa. Nedávno byl rozpor mezi naměřenou a odvozenou molekulovou hmotností vysvětlen tím, že se ukázalo, že CotB je zpočátku syntetizován jako 46 kDa a přeměněn na 59 kDa homodimer , který si zachovává oba N- a C-konce předpovězené z nukleotidové sekvence CotB.

Strategie pro získání rekombinantního B. subtilis spor exprimujících CotB-TTFC nebo CotB-LTB na svém povrchu byla založena na i) použití genu cotB a jeho promotoru pro konstrukci translačních fúzí a ii) chromozomální integraci fúzí genů cotB-tetC a cotB-eltB do kódující sekvence neesenciálního genu amyE (obrázek 3A) . Umístění fúzních proteinů pod transkripční a translační signály cotB zajistilo správné načasování exprese během sporulace, zatímco jejich chromozomální integrace zaručila genetickou stabilitu konstruktu. Vzhledem k nedostatku informací o sestavování pláště CotB a o požadavcích na kotevní motivy byly první pokusy provedeny umístěním pasažérského proteinu na C-konec, N-konec nebo doprostřed CotB (obr. 3B).

Systém zobrazení na povrchu pórů u B. subtilis . (A) Schematický pohled na integraci genových fúzí na chromozomu. Červené pruhy představují genovou fúzi, šedé a zelené pruhy představují neesenciální gen amyE B. subtilis použitý jako integrační místo a gen chloramfenikol acetyltransferázy (cat) použitý jako selekční marker. (B) Schematické znázornění fúzních proteinů s použitím buď CotB v plné délce (380 aminokyselin), nebo CotBΔ105 (275 aminokyselin), nebo CotC (66 aminokyselin) jako nosných proteinů (vše modře). Tři 27-aminokyselinové repetice plné délky CotB a jejich zbývající část v CotBΔ105 jsou vyznačeny černě. Fialové pruhy představují heterologní část fúzí (TTFC nebo LTB).

Pokud byly TTFC a LTB fúzovány na C-terminální konec CotB, chimérické proteiny se nedokázaly správně sestavit na povrchu spór (Isticato a Ricca, nepublikováno). Tato počáteční selhání byla přisuzována možné nestabilitě konstruktů, a to buď na úrovni DNA (repetitivní sekvence DNA), nebo na úrovni proteinů. Aby se tyto problémy obešly, byly TTFC a LTB fúzovány s C-koncem formy CotB, z níž byly odstraněny tři repetice 27 aminokyselin, CotBΔ105-TTFC (obr. 3A). Na rozdíl od verze v plné délce byl chimérický protein CotBΔ105-TTFC správně sestaven a vystaven na povrchu spór. Kvantitativní dot blot ukázal, že každá rekombinantní spóra vystavila množství fúzního proteinu CotBΔ105-TTFC rovnající se 0,00022 pg, z čehož lze usuzovat, že na povrchu každé rekombinantní spóry je přítomno 1,5 × 103 chimérických molekul .

Na rozdíl od CotBΔ105-TTFC nebyl CotBΔ105-LTB správně sestaven. Kmen exprimující tuto chiméru vykazoval sníženou účinnost sporulace a klíčení a jeho spory nebyly odolné vůči lysozymu. Tato pozorování spolu s analýzou SDS-PAGE uvolněných proteinů pláště naznačují, že přítomnost CotBΔ105-LTB silně změnila vrstvu pláště spór. In-silico analýza ukázala určitou homologii mezi chimérickým produktem (ve fúzní oblasti) a LytF, endopeptidázou asociovanou s buněčnou stěnou, kterou B. subtilis produkuje během vegetativního růstu, což zvyšuje možnost, že by chimérický produkt mohl narušovat správnou tvorbu pláště degradací některých složek pláště (Mauriello a Ricca, data neuvedena).

Kromě výše popsané fúze na C-konci byl modelový pasažérský protein TTFC fúzován také na N-konci a uprostřed CotB (obr. 3B). V obou případech byla použita forma CotBΔ105 CotB, aby se předešlo problémům, které se vyskytly u C-terminální fúze (viz výše). Jak při N-terminální, tak při sendvičové fúzi vznikly chimerické produkty, které byly správně sestaveny do struktury pláště jak z kvalitativního, tak z kvantitativního hlediska . Přinejmenším v případě CotB pak bylo možné dojít k závěru, že tam, kde je vystaven pasažérský protein, neovlivňuje zobrazení na povrchu spór.

CotC jako nosný protein

CotC je 12 kDa, alkalicky rozpustná složka pláště spór B. subtilis, která byla dříve identifikována pomocí reverzní genetiky a poté přiřazena k vnější vrstvě pláště na základě genetických důkazů . CotC byl původně považován za kandidáta na přenašeče kvůli svému relativnímu množství v plášti (obrázek 1B). Spolu s CotG a CotD představuje CotC přibližně 50 % všech solubilních proteinů pláště. Takto relativně vysoké množství by mohlo umožnit sestavení značného počtu chimér na bázi CotC na plášti, a zajistit tak účinné heterologní zobrazení. Exprese genu cotC je pod kontrolou σ-faktoru σK specifického pro mateřské buňky a transkripčních regulátorů GerE a SpoIIID. Stejně jako v případě CotB je i CotC transkribován v mateřské buňce a jeho montáž na plášť nevyžaduje membránovou translokaci. Primárním produktem genu cotC je polypeptid o 66 aminokyselinách extrémně bohatý na tyrosinové (30,3 %) a lysinové (28,8 %) zbytky . Nedávno se však ukázalo, že CotC je sestaven do nejméně čtyř různých proteinových forem, jejichž velikost se pohybuje mezi 12 a 30 kDa . Dvě z nich, které mají molekulovou hmotnost 12 a 21 kDa a odpovídají s největší pravděpodobností monomerní, respektive homodimerní formě CotC, jsou sestaveny na tvořící se spóře hned po jejich syntéze osm hodin po začátku sporulace. Další dvě formy, 12,5 a 30 kDa, jsou pravděpodobně produkty posttranslačních modifikací dvou dalších forem, ke kterým dochází přímo na povrchu pláště během zrání spór .

V případě CotC byly dosud zkonstruovány pouze C-terminální fúze (obr. 3B). Obě genové fúze CotC-TTFC a CotC-LTB byly získány klonováním tetC nebo eltB v rámci s posledním kodonem cotC pod transkripční a translační kontrolou promotorové oblasti cotC. Genová fúze byla poté integrována do chromozomu B. subtilis v lokusu amyE dvojitou křížovou rekombinací (obrázek 3A). Oba tyto chimérické proteiny se montovaly na plášť rekombinantních spor bez významnějšího vlivu na strukturu a/nebo funkci spor, protože se jevily jako identické se sporami divokého typu, pokud jde o účinnost sporulace a klíčení a rezistenční vlastnosti. Western blot, cytofluorimetrická analýza a v případě CotC-TTFC imunofluorescenční mikroskopie (obrázek 4) ukázaly, že obě chiméry na bázi CotC byly zobrazeny na povrchu rekombinantních spor. Kvantitativní stanovení rekombinantních proteinů exponovaných na sporách B. subtilis ukázalo, že cca. 9,7 × 102 a 2,7 × 103 molekul CotC-TTFC, resp. 2,7 × 103 molekul CotC-LTB z každé spory.

Detekce přítomnosti CotC-LTB a CotC-TTFC pomocí imunofluorescenční mikroskopie. Sporulace kmenů B. subtilis byla vyvolána metodou resuspenze a vzorky byly odebrány 6 hodin po začátku sporulace a analyzovány pomocí imunofluorescenční mikroskopie, jak bylo popsáno dříve . Vzorky byly označeny myší protilátkou anti-LTB následovanou konjugátem proti myšímu IgG-TRITC (červený fluorescein, panely A & B) nebo králičí protilátkou anti-TTFC následovanou konjugátem proti králičímu IgG-FITC (zelený fluorescein, panely C & D). Panely A & C, spory divokého typu; panel B, izogenní spory exprimující CotC-LTB); panel D, izogenní spory exprimující CotC-TTFC.

Ačkoli se zdá, že CotC je v plášti hojnější než CotB, systémy založené na CotC a CotBΔ105 exponují srovnatelné množství heterologních proteinů. Tento výsledek byl poněkud neočekávaný, protože CotC se zdá být v srsti mnohem hojnější než CotB. Možné vysvětlení vychází z nedávného zjištění, že C-terminální konec CotC je nezbytný nejen pro interakci s ostatními molekulami CotC, ale také s ostatními složkami pláště (Isticato a Ricca, rukopis v přípravě), a proto ukazuje, že použití CotC jako nosiče je třeba ještě optimalizovat.

Stabilita proteinů zobrazených ve spórách

Jedním z hlavních důvodů, proč navrhnout použití bakteriální spóry jako výhodného systému zobrazení, je její dobře zdokumentovaná stabilita. Spory lze jednoduše dlouhodobě skladovat při pokojové teplotě, aniž by došlo ke snížení jejich odolnosti a stabilních vlastností. To by byla mimořádně užitečná vlastnost pro různé biotechnologické aplikace. Pokud je například pasažérským proteinem antigen, mohla by se rekombinantní spóra stát ideální tepelně stabilní perorální vakcínou pro použití v rozvojových zemích, kde je tepelná stabilita nejvíce problematická kvůli špatné distribuci a skladování.

Ačkoli je však stabilita spór dobře zdokumentována , stabilita heterologních proteinů vystavených na povrchu spór byla zkoumána teprve nedávno. Spory exprimující CotBΔ105-TTFC (viz výše) a rodičovské spory byly skladovány při -80 °C, -20 °C, +4 °C a při pokojové teplotě a testovány při různých dobách skladování až 12 týdnů. Ve všech případech se množství heterologního proteinu přítomného na povrchu rekombinantních spor jevilo jako shodné mezi čerstvě připravenými sporami a sporami skladovanými po dobu až 12 týdnů (obr. 5). Tyto výsledky, které naznačují, že heterologní proteiny mohou být stabilně exponovány na povrchu rekombinantních spor, potvrzují systém založený na sporách jako velmi slibný způsob zobrazení, který by mohl překonat některé nevýhody jiných systémů a který by mohl najít uplatnění v řadě různých biotechnologických oblastí.

Bodová analýza proteinů extrahovaných ze spor divokého typu a ze spor vystavených chiméře CotBΔ 105 -TTFC. Čerstvě purifikované spory exprimující chiméru CotBΔ105-TTFC (t0) nebo po 4, 8 nebo 12 týdnech (t4, t8 a t12) skladování při pokojové teplotě byly zkoumány metodou dot blottingu extrahovaných proteinů z pláště spory. Jsou uvedeny koncentrace purifikovaného TTFC (v nanogramech) a proteinů pláště (v mikrogramech). Proteiny byly načteny a reagovaly s monoklonálními protilátkami proti TTFC (Boeringher), poté se sekundárními protilátkami konjugovanými s fosfatázou. Signály podobné intenzity byly získány s čerstvě purifikovanými sporami a sporami skladovanými při pokojové teplotě po dobu až 12 týdnů.

Důkaz principu orální vakcinace s využitím tetanu jako modelového onemocnění

Spory exprimující CotBΔ105-TTFC byly použity k imunizaci myší orální cestou . Sérové IgG a fekální sIgA vykazovaly jasnou sérokonverzi na TTFC. Dávkovací schéma používalo tři sady po třech dávkách (1,67 × 1010) po dobu 5 týdnů a vycházelo z režimů optimalizovaných pro orální imunizaci. Titry IgG specifických pro TTFC po 33 dnech (>103) naznačují, že byly na ochranné úrovni a myši vystavené tetanovému toxinu odpovídajícímu 10 LD50 byly plně chráněny. Z osmi myší, kterým byla podána dávka 20 LD50, jich sedm přežilo, což naznačuje, že tato dávka byla prahem ochrany. Podobná studie byla provedena pomocí nosní imunizace sporami CotB-TTFC, ale s nižší dávkou a třemi imunizacemi. Zde byly odpovědi specifických IgG TTFC nižší, ale stále vykazovaly sérokonverzi. Tyto studie ukazují, že upravené spory exprimující heterologní antigen lze použít k ochranné imunizaci. Navíc, i když slizniční odpovědi nejsou důležité pro ochranu proti Clostridium tetani (systémový patogen), jsou zřejmě důležité pro slizniční patogeny. Bude zapotřebí dalších studií k optimalizaci dávkovacích režimů (menší dávky a méně spor), ale tyto zásadní studie otevřely cestu k vývoji proti specifickým slizničním patogenům. Ačkoli jsou tyto studie povzbudivé a prokazují humorální reakce, zatím neexistují jasné důkazy, které by naznačovaly buněčné reakce. Bylo však prokázáno, že spory se šíří do GALT a nacházejí se v Peyerových políčkách (PP) a mezenterických lymfatických uzlinách . Malá velikost spór (1 μm) by umožnila, aby byly zachyceny M-buňkami a přeneseny do PP, kde by mohly interagovat s buňkami prezentujícími antigen. První studie ukázaly, že spory mohou klíčit a po krátkou dobu přetrvávat ve střevních makrofázích a také vyvolávat Th 1 cytokiny in vivo, jako je IFN-γ .

.