“ Jak velká je buňka E. coli a jaká je její hmotnost?

Jak velká je buňka E. coli a jaká je její hmotnost?

Režim čtení

Tabulka 1: Vztah mezi hmotností bakterie a dobou dělení. Hmotnost sušiny jedné buňky je uvedena jako funkce generační doby (doby dělení). Předpokládá se, že hmotnost roste zhruba exponenciálně s rychlostí růstu, jak původně pozorovali M. Schaechter et al J. Gen. Microbiol., 19:592, 1958. Hmotnost buněčné sušiny byla vypočtena pomocí hodnoty 173 µg na jednotku OD460 jednoho ml (BNID 106437). Použitý kmen je B/r, kmen běžně používaný v raných studiích bakteriální fyziologie. Hodnoty převzaty z F. C. Neidhardt, „Escherichia coli and Salmonella:

Velikost typické bakterie, jako je E. coli, slouží jako vhodné standardní pravítko pro charakterizaci délkových měřítek v molekulární a buněčné biologii. „Pravidlo“ založené na generacích měření světelnou a elektronovou mikroskopií pro rozměry buňky E. coli je přiřadit jí průměr přibližně ≈1µm, délku ≈2µm a objem ≈1µm3 (1 fL) (BNID 101788). Tvar lze aproximovat jako sférocylindr, tj. válec s polokulovitými uzávěry. Vzhledem k uvedenému průměru a délce můžeme vypočítat přesnější odhad objemu ≈1,3 µm3 (přesněji 5π/12). Rozdíl mezi touto hodnotou a výše uvedenou hodnotou podle pravidla palce ukazuje míru nekonzistence, se kterou při používání pravidel palce pohodlně žijeme. Jednou z nejjednodušších cest k odhadu hmotnosti bakterie je využít objemu ≈1 µm3 buňky E. coli a předpokládat, že má stejnou hustotu jako voda. Tento naivní odhad vede k další standardní hodnotě, a sice že bakterie jako E. coli má hmotnost ≈1 pg (pico=10-12). Protože většinu buněk tvoří asi ze 2/3 voda (BNID 100044, 105482) a ostatní složky, jako jsou bílkoviny, mají charakteristickou hustotu asi 1,3násobek hustoty vody (BNID 101502, 104272), je přepočet z buněčného objemu na hmotnost přesný asi na 10 %.

Obr. 1: Vztah mezi objemem buněk a rychlostí růstu. Pomocí mikroskopie a mikrofluidních zařízení lze měřit objem buněk na úrovni jedné buňky za různých podmínek, což potvrzuje, že průměrný objem buněk roste exponenciálně s rychlostí růstu. Naproti tomu variace mezi buňkami pro danou podmínku se škáluje různě. Variabilita chování jednotlivých buněk se používá k testování modelů regulace velikosti buněk. (Převzato z S. Taheri-Araghi et al., Curr. Biol. 25:385, 2015.)

Jeden z klasických výsledků bakteriální fyziologie zdůrazňuje, že plasticita vlastností buněk vyplývá ze závislosti hmotnosti buněk na rychlosti růstu. Zjednodušeně řečeno, rychlejší tempo růstu je spojeno s většími buňkami. Toto pozorování se týká fyziologických změn, kdy média, která zvyšují rychlost růstu, dávají také větší buňky, jak ukazuje obrázek 1. Bylo zjištěno, že to platí i z genetického hlediska, kdy dlouhodobé experimentální vývojové studie, které vedly k rychlejšímu růstu, vykazovaly větší objemy buněk (BNID 110462). Taková pozorování nám pomáhají vyvrátit mýtus „buňky“ – kdy lidé, často bezdůvodně, používají měření o jedné buňce k vyvozování závěrů o jiných typech buněk nebo o stejném typu buněk za jiných podmínek. Klasické studie Dennise a Bremera tato měření systematizovaly a zjistily, že hmotnost sušiny kolísá, jak ukazuje tabulka 1, od průměrné hodnoty 148 fg u buněk dělících se každých 100 minut až po 865 fg u buněk s dobou dělení 24 minut, což znamená více než pětinásobný rozdíl v závislosti na rychlosti růstu. Podobný trend byl pozorován i u jiných organismů (např. u poupat kvasinek, BNID 105103). Při přibližně 70 % vody tyto hodnoty odpovídají rozmezí přibližně 0,4 až 2,5 µm3 z hlediska objemu. Jak lze zdůvodnit větší rozměry u buněk rostoucích rychlejším tempem? Tato otázka je dodnes předmětem diskusí (Molenaar D. et al. MSB 5:323, 2009; Amir, A., Phys. Rev, Let., 112:208102, 2014). Vysvětlení se různí, od domněnky, že má výhodu ve způsobu přidělování zdrojů, až po tvrzení, že jde vlastně jen o vedlejší účinek toho, že má zabudovanou dobu přibližně 60 minut od okamžiku, kdy se buňka rozhodne, že nashromáždila dostatek hmoty k zahájení příprav na dělení, do doby, kdy dokončí replikaci DNA a akt dělení. Tato zhruba konstantní doba „zpoždění“ vede v tomto směru uvažování k exponenciální závislosti průměrné hmotnosti buňky na rychlosti růstu (Amir, A., Phys. Rev, Let., 112:208102, 2014).

Metody měření objemu buněk sahají od použití Coulterova počítadla ((BNID 100004), které odvozuje objem na základě změn odporu malého otvoru při průchodu buňky v něm, až po přímější měření pomocí fluorescenční mikroskopie, která měří délku a průměr buněk za různých podmínek (obrázek 1 a BNID 106577, 111480). Skutečnost, že se různé laboratoře neshodují vždy na stejných hodnotách, může být překvapivě způsobena rozdíly v kalibračních metodách nebo přesných kmenech a podmínkách růstu. Bezprecedentní schopnost měřit hmotnost buněk je dosažena efektivním vážením buněk na mikroskopické konzole. Jak je znázorněno na obrázku 2A, proudění kapaliny se využívá k tomu, aby se buňka v dutém kantileveru pohybovala sem a tam. Při měření se využívá skutečnosti, že hmotnost buňky ovlivňuje frekvenci oscilací konzoly. Tuto frekvenci lze měřit s fenomenální přesností a použít ji k odvození hmotnosti s přesností na femtogramy. Změnou směru proudění kapaliny je buňka zachycena na několik minut nebo déle a její hmotnostní akumulace se měří nepřetržitě na úrovni jedné buňky. Při prvním použití této techniky se ukázalo, že jednotlivé buňky, které jsou větší, také rychleji akumulují hmotnost, což vrhá světlo na dlouholetou otázku: je růst buněk lineární s časem, nebo je vhodnější jej popsat přibližně exponenciálním trendem? Rozdíly mohou být nepatrné, ale díky těmto revolučním možnostem bylo jasně vidět, že druhý scénář lépe vystihuje situaci u několika testovaných typů buněk, jak ukazuje obrázek 2B.

Obr. 2: Použití vztlakové hmoty k měření růstu jednotlivých buněk. (A) Konzola v mikronovém měřítku osciluje při vysoké frekvenci a hmotnost buněk lze určit ze změn frekvence oscilací. (B) Výsledkem měření v průběhu času je křivka akumulace hmotnosti jednotlivých buněk, jak je znázorněno na obrázku. (C) Zde jsou zobrazeny buňky B. subtilis. Srovnání předpovědí lineárního a exponenciálního modelu růstu je znázorněno jako nejlepší shody. Podobnost ukazuje, jak blízko jsou si oba modely v rozsahu pouhého dvojnásobného nárůstu v průběhu buněčného cyklu. Suchá hmotnost buněk je přibližně čtyřnásobkem vztlakové hmotnosti. (Převzato z M. Godin et al., Nature Meth. 7:387, 2010.)

.