Jak poznám, že protilátka bude zkříženě reagovat?

Křížová reakce nastává, když protilátka zvýšená proti jednomu specifickému antigenu rozpozná dva antigeny, které mají podobné strukturní oblasti.

Co je to křížová reakce?

Protilátka má specifickou sekvenci aminokyselin (oblast Fab), která určuje její afinitu k určitému antigenu. Zkřížená reaktivita mezi antigeny nastává, když protilátka zvýšená proti jednomu specifickému antigenu má konkurenční vysokou afinitu k jinému antigenu. K tomu často dochází, když mají dva antigeny podobné strukturní oblasti, které protilátka rozpoznává.

Křížová reaktivita může znehodnotit výsledky experimentu a ovlivnit tak vědeckou reprodukovatelnost. Proto je testování protilátky na křížovou reaktivitu s blízce příbuznými proteiny kritickým validačním experimentem.

Jak zkontrolovat křížovou reaktivitu?

Křížová reaktivita není vždy negativní vlastností. Někdy může zlepšit užitečnost protilátky. Například křížová reaktivita protilátky pro cíl napříč druhy umožňuje použití stejné protilátky u více modelových organismů.

Křížová reaktivita napříč druhy se často vyskytuje u protilátek odvozených od lidských antigenů. Mnoho lidských protilátek v katalogu Proteintech má významnou zkříženou reaktivitu s homologními proteiny v jiných než lidských modelech, jako je myš, potkan, opice nebo zebřička.

Na základě homologie proteinové sekvence a publikací s použitím našich protilátek u nehumánních organismů lze mnoho protilátek společnosti Proteintech použít nejen pro lidské vzorky, ale také pro různé organismy. Homologii lze ověřit pomocí párového zarovnání sekvence imunogenu a cílového antigenu prostřednictvím webové stránky NCBI-BLAST a další informace lze ověřit na webové stránce univerzálního zdroje proteinů UniProt.

Jaké je „správné číslo“ homologie pro předpověď zkřížené reaktivity?

Na základě našich zkušeností, pokud imunogen a sekvence potenciálního zkříženě reagujícího proteinu sdílejí 75 % sekvenční homologii, předpokládá se, že budou zkříženě reagovat. Pokud je váš vzorek jiný než lidský, doporučuje se polyklonální, protože existuje směs rozpoznávaných epitopů.

Reaguje moje protilátka zkříženě s jinými druhy?

Záleží na míře podobnosti sekvence proteinu mezi imunogenem a sekvencí potenciálního zkříženě reagujícího proteinu.

Jak se vyhnout zkřížené reaktivitě při Western blotu

Pokud je to možné, doporučuje se použít sekundární protilátku specifickou pro první použitou protilátku; například pokud je primární protilátka myší, pak by sekundární protilátka měla být anti-myší IgG-HRP. V případě, že je sekundární protilátka polyklonální a vytvořená proti celé molekule IgG, pak králičí protilátka rozpoznávající primární myší Ab nemusí být nejlepší volbou z důvodu rozpoznání společné oblasti lehkého řetězce Kappa.

Jak se vyhnout zkřížené reaktivitě během pokusů s imunobarvením

Zkřížená reaktivita se může vyskytnout při testech imunobarvení s použitím vzorků získaných z tkání; proto je běžné používat jako primární imunoglobuliny spíše fragmenty než celé IgG (například při práci s myšími protilátkami na myších tkáních). Navíc při vícenásobném barvení, aby se zajistilo, že nedojde ke zkřížené reakci, zkuste použít různé sekundární protilátky, například 568 králičí proti kozí s 488 králičí proti myší, které jsou poměrně běžné a snadno dostupné.

Co je to zkřížená adsorpce a zkřížená reaktivita sekundárních protilátek?

Zkřížené sekundární protilátky jsou takové polyklonální protilátky, které se vyrábějí s dalším purifikačním krokem, aby se odfiltrovaly členy, které se vážou na necílové druhy imunoglobulinů (IgG). Tento proces může snížit druhovou zkříženou reaktivitu a zvýšit specifitu. V závislosti na uspořádání experimentu existují odrůdy sekundárních protilátek se zkříženou a vysoce zkříženou adsorpcí.

1. Polyklonální vs. monoklonální protilátky

2. Výběr sekundární protilátky

3. Proteinový nebo peptidový antigen? Výhody a nevýhody