Izoenzym alkalické fosfatázy

Genomická struktura, chemie proteinů a enzymologie alkalické fosfatázy

ALP (orthofosforečná-monoesterová fosfohydroláza, alkalické optimum, EC 3.1.3.1) se vyskytuje v přírodě u rostlin a živočichů (McComb et al., 1979). U člověka jsou čtyři izoenzymy ALP kódovány čtyřmi samostatnými geny (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Tři z těchto izoenzymů mají v podstatě tkáňově specifickou expresi a označují se jako střevní, placentární a zárodečně-buněčná (placentě podobná) ALP. Čtvrtý izoenzym ALP je exprimován všudypřítomně, a proto se označuje jako TNSALP (Stigbrand a Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Na TNSALP je bohatá zejména kosterní, jaterní a ledvinová tkáň. Charakteristické fyzikálně-chemické vlastnosti (tepelná stabilita, elektroforetická pohyblivost atd.) mezi ALP purifikovanými z lidských kostí, jater a ledvin se po vystavení glykosidázám ztrácejí (Moss a Whitaker, 1985), a TNSALP je proto rodinou „sekundárních“ izoenzymů (budu je nazývat „izoformy“). Jsou kódovány stejným genem, mají identickou polypeptidovou sekvenci a liší se pouze posttranslačními modifikacemi zahrnujícími sacharidy (Harris, 1980).

Mapový symbol genu pro TNSALP je ALPL („ALP-liver“), ačkoli funkce jaterní izoformy TNSALP není známa (viz dále). ALPL se nachází poblíž konce krátkého raménka chromozomu 1 (1p36.1-p34), zatímco geny pro střevní, placentární a zárodečné ALP jsou na konci dlouhého raménka chromozomu 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL zřejmě představuje ancestrální gen, zatímco tkáňově specifické ALP pravděpodobně vznikly duplikací genů (Harris, 1990). ALPL je o něco větší než 50 kb a obsahuje 12 exonů, z nichž 11 je překládáno za vzniku zralého enzymu sestávajícího z 507 aminokyselinových zbytků (Weiss et al., 1988b). Sekvence TATA a Sp1 mohou být regulačními prvky, ale zdá se, že základní exprese odráží „housekeeping“ účinky promotoru, zatímco rozdílná exprese v různých tkáních může být zprostředkována posttranskripčním mechanismem (Kiledjian a Kadesch, 1990). ALPL má dva promotory a dva odpovídající 5′ nekódující exony, 1a a 1b. Výsledkem jejich exprese jsou dvě různé mRNA s různými 5′ nepřekládanými oblastmi (Nosjean et al., 1997). Transkripce probíhá přednostně z horního promotoru (1a) v osteoblastech a z dolního promotoru (1b) v játrech a ledvinách (Millán, 2006).

Tkáňově specifické geny ALP jsou menší než ALPL, především díky kratším intronům. Aminokyselinové sekvence odvozené z jejich cDNA naznačují 87% polohovou identitu mezi placentárním a střevním ALP, ale pouze 50-60% identitu mezi tkáňově specifickými ALP a TNSALP (Harris, 1990).

Sekvence aminokyselinových zbytků TNSALP naznačuje pět potenciálních míst N-vázané glykosylace (Weiss et al., 1988). N-glykosylace je nezbytná pro katalytickou aktivitu. O-glykosylace charakterizuje kostní, ale nikoli jaterní izoformu (Nosjean et al., 1997).

V roce 2000 byla vymezena krystalová struktura lidské placentární ALP s rozlišením 1,8Å (Le Due et al., 2000). Aktivní místo TNSALP by vycházelo z nukleotidové sekvence konzervované v ALP v celé přírodě (Henthorn a Whyte, 1992), odráží šest exonů a zahrnuje 15 aminokyselinových zbytků (Zurutuza a kol., 1999).

ALP jsou Zn++-metaloenzymy (McComb a kol., 1979). Katalytická aktivita vyžaduje multimerní konfiguraci identických podjednotek, přičemž každý monomer má jedno aktivní místo a dva atomy Zn++, které stabilizují terciární strukturu (Kim a Wycoff, 1991).

ALP jsou v oběhu obecně považovány za homodimerní (McComb et al., 1979). TNSALP má ve své symetrické dimerní formě topologii αβ pro každou podjednotku včetně desetivláknového β-řetězce ve svém středu (Hoylaerts a Millán, 1991). Ve tkáních jsou však ALP vázány (viz dále) na buněčné povrchy, snad jako homotetramery (Fedde et al., 1988).

In vitro mají ALP širokou substrátovou specifitu a pH optima, která závisí na typu a koncentraci katalyzované fosforové sloučeniny (McComb et al., 1979). Katalytická aktivita vyžaduje Mg++ jako kofaktor (McComb et al., 1979). PPi i fosfoestery mohou být hydrolyzovány (Xu et al., 1991). Reakce zahrnuje fosforylaci-defosforylaci serinového zbytku. Zdá se, že rychlost limitujícím krokem je disociace kovalentně vázaného Pi. Pi je totiž silným kompetitivním inhibitorem ALP (McComb et al., 1979; Kim a Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Je však také možné, že Pi stabilizuje enzym (Farley, 1991).

O biosyntéze ALP u vyšších organismů přetrvávají nejasnosti. Genové sekvence lidských izoenzymů ALP naznačují, že vznikající polypeptidy mají krátkou signální sekvenci o 17-21 aminokyselinových zbytcích (Harris, 1990) a hydrofobní doménu na svém karboxylovém konci (Weiss et al., 1988b). Na intracelulární degradaci ALP se mohou podílet proteasomy (Cai et al., 1998). Nicméně tyto ALPs se vážou na vnější povrch plazmatických membrán vázané na polární hlavovou skupinu fosfatidylinositol-glykanové části (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) a mohou být uvolněny fosfatidylinositol-specifickou fosfolipasou (Fedde et al., 1988). Jejich přesná interakce s fosfatidylinositolem se však může u jednotlivých izoenzymů ALP lišit (Seetharam et al., 1987).

Běžně se v oběhu vyskytuje ALP bez lipidů. Přesto mechanismy uvolňování ALP z buněčných povrchů nejsou známy. Proces by mohl zahrnovat fosfatidázu typu C nebo D, působení detergentů, proteolýzu, frakcionaci membrán nebo lipolýzu (Alpers et al., 1990).

U zdravých mužů a žen pochází téměř veškerá aktivita ALP v séru nebo plazmě z přibližně stejného množství kostní a jaterní izoformy TNSALP (Millán et al., 1980). Kojenci a děti, zejména novorozenci a dospívající, mají vyšší hladiny kostní izoformy v krevním oběhu (McComb et al., 1979). U některých jedinců s krevními skupinami B a O, kteří jsou „vylučovači“, se po požití tučného jídla zvyšuje malé množství střevní ALP v oběhu (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). Obvykle však střevní ALP přispívá k celkové aktivitě ALP v séru jen několika procenty (maximálně 20 %) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). Placentární ALP je obvykle exprimována a cirkuluje pouze během posledního trimestru těhotenství (Birkett et al., 1966). Různé druhy rakoviny však uvolňují do krevního oběhu placentární nebo germinální („placentě podobnou“) ALP (Millán, 1988). Clearance cirkulujícího ALP, stejně jako u mnoha jiných glykoproteinů, pravděpodobně zahrnuje vychytávání a degradaci játry (Young et al., 1984).

.