ISH: protokol hybridizace in situ

Skladování vzorků

Konzervace RNA
Konzervace RNA je ztížena přítomností enzymu RNázy. Tento enzym se nachází na skleněném nádobí, v reagenciích a na operátorech a jejich oblečení. RNáza rychle ničí veškerou RNA v buňce nebo samotnou sondu RNA, takže uživatelé musí zajistit, aby používali sterilní techniky, rukavice a roztoky a zabránili tak kontaminaci sondy nebo tkáňové RNA RNázou.

Obecné skladování vzorků při použití zmrazených řezů
Pro dosažení nejlepších výsledků u starších preparátů neskladujte preparáty na sucho při pokojové teplotě. Místo toho je uchovávejte ve 100% etanolu při -20 °C nebo v plastové krabičce obalené saranovou fólií při -20 °C nebo -80 °C. Takové skladování uchová preparáty po dobu několika let.

Výběr sondy

Sondy RNA

Sondy RNA by měly mít délku 250-1 500 bází; sondy o délce přibližně 800 bází vykazují nejvyšší citlivost a specifičnost. Transkripční šablony by měly umožňovat transkripci jak RNA sondy (antisense vlákno), tak negativní kontroly (sense vlákno). Klonujte do vektoru s opačnými promotory, abyste toho dosáhli. Kruhové šablony musí být před vytvořením sondy linearizovány, ačkoli lze použít i šablony PCR.

Sondy DNA

Sondy DNA poskytují vysokou citlivost pro hybridizaci in situ. Ve srovnání s RNA sondami nehybridizují tak silně s cílovými molekulami mRNA, proto by se při promývání po hybridizaci neměl používat formaldehyd.

Důležitá je specifičnost sondy. Pokud je známa přesná sekvence nukleotidů mRNA nebo DNA v buňce, lze navrhnout přesnou komplementární sondu. Pokud >5 % párů bází není komplementárních, bude sonda pouze volně hybridizovat s cílovou sekvencí. To znamená, že je pravděpodobnější, že se sonda během promývacích a detekčních kroků vymyje a nemusí být správně detekována.

Protokol in situ hybridizace RNA sondou značenou digoxigeninem (DIG)

Tento protokol popisuje použití jednovláknových RNA sond značených DIG k detekci exprese genu zájmu v parafinových řezech.

1) Deparafinizace

U zmrazených řezů začněte krokem 2. V případě, že se jedná o zmražené řezy, začněte krokem 3. V případě, že se jedná o zmražené řezy, začněte krokem 4. Pokud používáte formaldehydem fixované parafinové řezy, pokračujte tímto krokem.

Před pokračováním je třeba preparáty deparafinizovat a rehydratovat. Neúplné odstranění parafínu může způsobit špatné obarvení řezu.

Umístěte preparáty do stojanu a proveďte následující promývání:

• Xylen: 2×3 min
• Xylen 1:1 se 100% etanolem: 3 min
• 100% etanol: 2×3 min
• 95% etanol:
• 70 % ethanol: 3 min
• 50 % ethanol: 3 min
• Opláchněte studenou vodou z vodovodu

Sklíčka ponechte ve vodovodní vodě až do získání antigenu. Od tohoto okamžiku nesmí sklíčka vyschnout, protože by to způsobilo nespecifickou vazbu protilátek a vysoké zabarvení pozadí.

2) Retrieval antigenu

Trávení pomocí 20 µg/ml proteinázy K v předehřátém 50 mM Tris po dobu 10-20 min při 37 °C. Inkubační doba a koncentrace proteinázy K mohou vyžadovat optimalizaci

Doporučujeme vyzkoušet titrační experiment s proteinázou K pro stanovení optimálních podmínek. Nedostatečná digesce sníží hybridizační signál a nadměrná digesce bude mít za následek špatnou morfologii tkáně, což velmi ztíží lokalizaci hybridizačního signálu. Optimální koncentrace proteinázy K se bude lišit v závislosti na typu tkáně, délce fixace a velikosti tkáně.

3) Sklíčka 5x opláchněte v destilované vodě.
4) Sklíčka ponořte na 20 s do ledově studené 20% (v/v) kyseliny octové. Tím dojde k permeabilizaci buněk, aby byl umožněn přístup k sondě a protilátce.
5) Dehydratujte sklíčka promytím po dobu přibližně 1 min na jedno promytí v 70% ethanolu, 95% ethanolu a 100% ethanolu, poté je vysušte na vzduchu.
6) Na každé sklíčko přidejte 100 µl hybridizačního roztoku.

Roztok soli (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardtův roztok (100x)

• 10 g Ficollu
• 10 g PVP (polyvinylpyrolidin)
• 10 g hovězího sérového albuminu (BSA)
• .
• 500 ml sterilního dH2O

7) Inkubujte preparáty 1 h ve zvlhčené hybridizační komoře při požadované teplotě hybridizace. Typické hybridizační teploty se pohybují mezi 55-62 °C.
8) Zřeďte sondy v hybridizačním roztoku ve zkumavkách PCR. Zahřívejte při 95 °C po dobu 2 minut v bloku PCR, aby došlo k denaturaci RNA nebo DNA sondy. Ihned zchlaďte na ledu, abyste zabránili opětovnému žíhání.
9) Hybridizační roztok slijte. Přidejte 50-100 μl naředěné sondy na každý úsek, čímž pokryjete celý vzorek. Inkubujte ve zvlhčené hybridizační komoře při 65 °C přes noc. Přikryjte vzorek krycím sklíčkem, abyste zabránili odpařování.

Během tohoto kroku bude sonda RNA hybridizovat s odpovídající mRNA nebo sonda DNA bude hybridizovat s odpovídající buněčnou DNA. Teplotu hybridizace optimalizujte v závislosti na sekvenci použité sondy a také na typu buňky nebo tkáně. Tato teplota by měla být optimalizována pro každý analyzovaný typ tkáně.

Optimální hybridizační teplota pro sondy závisí na procentu bází přítomných v cílové sekvenci. Důležitým faktorem je koncentrace cytosinu a guaninu v sekvenci.

10) Promývání se strunou

Pro odstranění nespecifických interakcí lze manipulovat s parametry roztoku, jako je teplota, koncentrace soli a detergentu.

Pro přípravu 1 l 20x fyziologického roztoku citrátu sodného (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88 .2 g citrátu sodného
• 800 ml sterilního dH2O
• Nastavte pH na 5 pomocí kyseliny citronové, naplňte do 1 L a autoklávujte

Propláchněte 1

• 50% formamidem v 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Vymývání přebytečné sondy a hybridizačního pufru při vyšších teplotách (až 65°C) po krátkou dobu. Pokud se ponechá příliš dlouho, může dojít k vymytí příliš velkého množství hybridizované sondy RNA/DNA.

Vymývání 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Tento krok odstraní nespecifickou a/nebo opakovanou hybridizaci DNA/RNA.

Při optimalizaci teploty a koncentrace soli pro promývání stringence postupujte podle těchto pokynů:

• Pro velmi krátké DNA/RNA sondy (0.5-3 kb) nebo velmi složitých sond by měla být teplota promývání nižší (do 45 °C) a přísada soli nižší (1-2x SSC).
• Pro jednomístné nebo velké sondy by měla být teplota kolem 65 °C a přísada soli vysoká (pod 0,5 % SSC).
• Teplota a přísnost by měly být nejvyšší pro repetitivní sondy (např. alfa-satelitní repetice).

11) Promývejte dvakrát v MABT (pufr kyseliny maleinové obsahující Tween 20) po dobu 30 minut při pokojové teplotě. MABT je šetrnější než PBS a je vhodnější pro detekci nukleových kyselin.

Pro přípravu 5x zásobního roztoku MABT

• 58 g kyseliny maleinové
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 ml vody

Zvyšte pH na 7,5 přidáním báze Tris. Bude zapotřebí asi 100 g. Dosáhněte konečného objemu 1 l.

12) Vysušte sklíčka.
13) Přeneste do zvlhčené komory a ke každému řezu přidejte 200 µl blokovacího pufru (MABT + 2% BSA, mléko nebo sérum). Blokujte 1-2 h při pokojové teplotě.
14) Vypusťte blokovací pufr. Přidejte protilátku proti značce v požadovaném ředění do blokovacího pufru. Doporučenou koncentraci/ředění naleznete v datasheetu protilátky. Inkubujte 1-2 h při pokojové teplotě.
15) Promývejte preparáty 5×10 min s MABT při pokojové teplotě.
16) Promývejte preparáty 2×10 min vždy při pokojové teplotě s předbarvovacím pufrem (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) Pro detekci fluorescence přejděte ke kroku 18. Pro ostatní formy detekce vraťte preparáty do zvlhčené komory a postupujte podle pokynů výrobce pro vyvolání barvy.

18) Opláchněte sklíčka v destilované vodě.
19) Sklíčka sušte na vzduchu po dobu 30 min. Omyjte ve 100% ethanolu a důkladně vysušte na vzduchu.
20) Připevněte pomocí montážního roztoku DePeX.