Genetika myastenie gravis: Asociační studie případů a kontrol u řecké populace

Abstrakt

Myastenie gravis (MG) je heterogenní autoimunitní onemocnění charakterizované tvorbou autoprotilátek proti proteinům postsynaptické membrány v nervosvalovém spojení. Podíl genetických faktorů na náchylnosti k MG byl hodnocen prostřednictvím rodinných studií a studií dvojčat, nicméně přesné genetické pozadí onemocnění zůstává neobjasněno. Provedli jsme asociační studii případů a kontrol u 101 nepříbuzných pacientů s MG řeckého původu a 101 zdravých dobrovolníků s cílem posoudit podíl běžných genetických variant na náchylnosti k MG. Zaměřili jsme se na tři kandidátní geny, které byly jasně spojeny s několika autoimunitními onemocněními, s cílem prozkoumat jejich možný vliv na patogenezi MG. Jedná se o interferonový regulační faktor 5 (IRF-5), TNFα-indukovaný protein 3 (TNFAIP3), známý také jako A20, a interleukin-10 (IL-10), klíčové molekuly v regulaci imunitních funkcí. Byl zjištěn statistický trend asociace () mezi jednonukleotidovými polymorfismy (SNP) promotoru IL-10 a podskupinami pacientů s časným a pozdním nástupem MG. U ostatních zkoumaných variant nebyly pozorovány žádné statisticky významné rozdíly. Pokud je nám známo, jedná se o první celosvětový pokus zabývat se možným vztahem mezi společnými genetickými variantami IRF-5 a TNFAIP3 a genetickým základem MG.

1. Úvod

Myastenie gravis (MG) je orgánově specifické autoimunitní onemocnění způsobené autoprotilátkami namířenými proti proteinům postsynaptické membrány, které vede k poruše nervosvalového přenosu. Klinicky je MG charakterizována svalovou slabostí a rychlou únavou, která se zhoršuje cvičením a zmírňuje odpočinkem. Hlavním autoantigenem je u 80-90 % pacientů s MG svalový acetylcholinový receptor (AChR), pentamerový kanál, který zprostředkovává synaptický přenos na nervosvalovém spojení. U několika zbývajících pacientů s MG jsou detekovány autoprotilátky proti svalově specifické tyrozinkináze (MuSK) nebo proti proteinu souvisejícímu s lipoproteiny 4 (LRP4). MuSK i LRP4 tvoří receptorový komplex, který váže proteoglykan extracelulární matrix agrin, což vede ke shlukování AChR, kritickému pro funkci nervosvalového spojení.

Ačkoli je MG onemocnění, které postihuje obě pohlaví, ve všech věkových kategoriích a u všech ras , důkazy z několika epidemiologických studií ukázaly bimodální rozložení incidence v závislosti na pohlaví a věku, s jedním vrcholem ve druhém a třetím desetiletí života, pozorovaným převážně u žen, a druhým v šestém a sedmém desetiletí života, vyskytujícím se převážně u mužů . Výše uvedené pozorování vedlo ke klasifikaci MG na časnou, která se objevuje před 50. rokem života a obvykle souvisí s hyperplazií brzlíku, a pozdní MG (>50 let) s normálním nebo atrofickým brzlíkem.

Míra genetického podílu na náchylnosti k MG byla hodnocena prostřednictvím rodinných studií a studií dvojčat , což odráží rodinné seskupení onemocnění a následně genetickou dědičnost. Vysoká míra shody MG pozorovaná u jednovaječných dvojčat ve srovnání s dvojvaječnými dvojčaty silně naznačuje zapojení genetických faktorů do patogeneze MG . Několik studií navíc uvádí, že pacienti s MG mohou být postiženi i jiným autoimunitním onemocněním, nejčastěji poruchami štítné žlázy a revmatoidní artritidou . Toto zjištění vede k hypotéze, že dochází k obecnější poruše imunologických funkcí.

Komplex lidských leukocytárních antigenů (HLA) je významnou genomickou oblastí, která se podílí na vzniku MG. Alely HLA-A1 a B8 pro třídu I a DR3 pro třídu II tvoří rodový haplotyp označovaný jako „8.1“, který byl reprodukovatelně spojen s časným nástupem MG a hyperplazií thymu . Další výzkum zaměřený na rozčlenění tohoto rozšířeného haplotypu A1-B8-DR3 vedl k identifikaci lokusu MYAS1, oblasti o velikosti 1,2 Mb zahrnující 36 genů, na hranici oblasti třídy III a proximální oblasti třídy I, což vylučuje lokusy třídy II a potvrzuje převažující asociaci alely B8 nad alelou DR3 .

Kromě HLA byla zkoumána také řada genetických lokusů nespojených s HLA, pokud jde o jejich zapojení do náchylnosti k MG. Tyto poznatky byly odvozeny především na základě studií kandidátních genů, přičemž geny, u nichž byla zaznamenána souvislost nebo nesouvislost s MG, jsou podrobně rozebrány v .

Interferonový (IFN) regulační faktor 5 (IRF-5) je členem rodiny transkripčních faktorů IRF. IRF-5 je aktivován IFN-α/B a reguluje soubor prozánětlivých cytokinů, jako jsou IL-6, TNF-α a IL-12, přičemž dále indukuje expresi genů IFN. Výsledky několika studií, jejichž přehled je uveden v článku , ukazují, že IRF-5 je genem náchylnosti k SLE. Hledání běžných variant, které ovlivňují hladiny IRF-5, vedlo k identifikaci SNP rs10954213 (c.*555G > A), který se nachází v polyA+ signální sekvenci AATAAA v 3′ UTR. Alela G narušuje polyadenylační místo a transkripce je ukončena daleko po proudu, čímž vznikají delší a méně stabilní transkripty mRNA IRF-5 . Dále 30-bp in-frame insertion-deletion varianta (rs60344245) v šestém exonu IRF-5 určuje vznik dvou rodin proteinových izoforem, které mají rozdílnou schopnost iniciovat transkripci cílových genů IRF-5 .

Protein 3 indukovaný TNFα (TNFAIP3), známý také jako A20, je klíčovou molekulou v negativní zpětnovazební regulaci reakcí závislých na NF-κB. Inhibiční účinek TNFAIP3 na signalizaci NF-κB vzniká na základě kooperativní aktivity jeho dvou ubikvitin-editujících domén: N-koncové ovariální domény (OTU), která je zodpovědná za deubikvitinaci receptor interagujícího proteinu 1 (RIP1), nezbytného adaptorového proteinu signální dráhy indukované TNF, a C-koncové domény obsahující zinkový prst, která funguje jako E3 ubikvitin ligáza podporující proteasomální degradaci RIP1 .

SNP rs13207033 (g.137965418G > A), který se nachází v intergenové oblasti 6q23, přibližně 185 kb před TNFAIP3, pravděpodobně ovlivňuje expresi genu přítomností potenciálních regulačních prvků DNA . Jiná studie naznačila, že nesynonymní kódující SNP (c.380T > G, rs2230926), jehož výsledkem je změna fenylalaninu na cystein na zbytku 127 (p.F127C), v doméně OTU proteinu TNFAIP3, je spojen se SLE u osob evropského původu .

Interleukin-10 (IL-10) je pleiotropní cytokin vylučovaný různými typy buněk, jako jsou buňky T a buňky myeloidní linie. IL-10 byl charakterizován jako protizánětlivý cytokin díky svým stimulačním účinkům na buňky TH2 a současnému potlačení buněk TH1 . Kromě toho IL-10 indukuje proliferaci a diferenciaci aktivovaných B lymfocytů, což vede k další aktivaci humorální odpovědi. U experimentální autoimunitní MG (EAMG) způsobilo podávání IL-10 zvýšení hladin anti-AChR protilátek, což naznačuje roli IL-10 posilující onemocnění .

V 5′ doprovodné sekvenci lidského genu IL-10 bylo zaznamenáno několik variant. Tři SNP, konkrétně rs45552637 (A/C), rs1800872 (T/C) a rs1800896 (A/G), které se nacházejí na pozicích -592, -819 a -1082, určují vznik tří haplotypů (GCC, ACC a ATA). Poloha těchto SNP vychází z dříve publikované sekvence U16720, uložené v databázi EMBL-EBI. Studie Turnera a spolupracovníků uvádí korelaci těchto haplotypů s produkcí proteinu IL-10 in vitro . Konkrétně genotyp GCC/GCC byl spojen s vysokou produkcí IL-10 indukovanou konkanavalinem A, genotypy GCC/ACC a GCC/ATA se střední a genotypy ACC/ACC, ATA/ATA a ACC/ATA s nízkou produkcí IL-10 .

V současné studii byl přijat přístup založený na hypotézách s cílem posoudit zapojení určitých běžných variant do náchylnosti k MG. Provedli jsme tedy studii případové kontroly kandidátních genů se zaměřením na geny s kritickou úlohou ve funkci imunitního systému s cílem zjistit, zda dříve popsané asociace mezi výše uvedenými geny a jinými autoimunitními chorobami mohou platit i pro MG.

2. Materiály a metody

2.1. Studijní populace

Do této studie bylo zařazeno celkem 101 nepříbuzných pacientů s MG, všichni řeckého původu. Vzorky krve pacientů s MG byly odebrány v řeckém Pasteurově ústavu během rutinního diagnostického šetření. Do naší studie byli zařazeni pouze pacienti s MG pozitivní na AChR. Diagnóza MG byla stanovena na základě přítomnosti anti-AChR protilátek v séru pacienta pomocí radioimunoprecipitačního testu (RIPA). Z genetické analýzy jsme záměrně vyloučili pacienty, u nichž byla zjištěna pozitivita autoprotilátek proti MuSK, abychom snížili heterogenitu studijní skupiny. Ačkoli séra pacientů s MG nebyla analyzována na autoprotilátky anti-LRP4, absence tohoto testu nevyvolává problém s heterogenitou studijní populace, protože koexistence protilátek anti-LRP4 a anti-AChR je vzácná. Hlavní charakteristiky skupiny anti-AChR MG (věk při nástupu a pohlaví) jsou shrnuty v tabulce 1. Pacienti získali písemný informovaný souhlas. Kontrolní skupinu tvořilo 101 etnicky a pohlavím odpovídajících zdravých jedinců.

2.2. Charakteristiky studijní skupiny MG. Genotypizace

Genomová DNA každého jedince byla extrahována ze vzorku periferní žilní krve pomocí soupravy QIAamp Blood Midi (Qiagen GmbH, Hilden, Německo). Polymerázové řetězové reakce (PCR) byly provedeny pomocí soupravy KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA). Sekvence primerů jsou uvedeny v doplňkových materiálech jako doplňková tabulka 1 (viz tabulka 1 v doplňkových materiálech dostupných online na adrese http://dx.doi.org/10.1155/2012/484919), zatímco reakční podmínky jsou k dispozici na vyžádání.

Amplifikace pomocí PCR a elektroforézní analýza v agarosovém gelu byly použity ke genotypizaci 30 bp inserční/deleční varianty IRF5.

K detekci SNP rs2230926 (T > G) v TNFAIP3 byla použita analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) založená na PCR. Amplifikované fragmenty o délce 549 bp byly štěpeny restrikčním enzymem Fnu4HI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a poté byly analyzovány elektroforetickou separací na 2% w/v agarózovém gelu. Alela G vytváří restrikční místo Fnu4HI, což vede k natrávení amplikonů na fragmenty 319 a 230 bp.

Identifikace genotypů SNP promotoru IL-10 byla provedena přímým sekvenováním DNA podle Sangera. Pomocí PCR byl amplifikován fragment o délce 585 bp zahrnující všechny tři varianty. Produkty PCR byly přečištěny pomocí kolony PureLink PCR Purification kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Sekvence fragmentu o velikosti 585 bp byla stanovena pomocí chemické sady BigDye Terminator v3.0 na sekvenátoru DNA Applied Biosystems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Použité primery byly stejné jako primery pro amplifikaci této oblasti.

Oba SNP, rs10954213 (A/G) v 3′ UTR IRF5 a rs13207033 (G/A) nacházející se v intergenové oblasti 6q23, byly genotypizovány pomocí PCR v reálném čase a analýzy křivky tání s vysokým rozlišením (HRM) na cykléru v reálném čase RotorGene Q (Qiagen GmbH, Hilden, Německo). Amplifikace fragmentu obsahujícího zájmový SNP byla provedena pomocí soupravy Type-it HRM PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Německo) podle pokynů výrobce. Během HRM se teplota zvyšuje z 65 °C na 95 °C s rychlostí zahřívání 0,1 °C/2 s, což vede k denaturaci produktů PCR a generování křivek tání, charakteristických pro každý genotyp. Vzhledem k tomu, že změna jediného páru bází způsobuje výrazný posun teploty tání (), je genotypizace založena na analýze profilů tání: homozygoti pro alelu A vykazují podobné profily tání a s nižší , ve srovnání s homozygoty G/G, zatímco heterozygoti jsou odlišeni změnou tvaru křivky tání.

Ve všech procesech genotypizace nebyly pečlivě zahrnuty kontroly templátu. Negativní a pozitivní kontrolní vzorky byly nejprve identifikovány pomocí sekvenování DNA a následně byly použity ve všech metodách genotypování. Každý vzorek byl testován duplicitně, s výjimkou vzorků analyzovaných metodou PCR-RFLP a sekvenováním DNA.

2.3 Analýza genotypu. Statistická analýza

Rozdíly v rozložení genotypů a frekvencích alel mezi případy a kontrolami byly vypočteny analýzou nebo Fisherovým exaktním testem. hodnoty menší než 0,05 byly považovány za statisticky významné.

3. Výsledky

Rozložení genotypů všech variant odpovídalo Hardy-Weinbergově rovnováze jak u pacientů s MG, tak u kontrolních skupin (údaje nejsou uvedeny).

Frekvence alel a genotypů varianty IRF-5 rs60344245 vykazovaly podobné rozložení ve vyšetřených skupinách 101 pacientů s MG a 100 kontrol (). Pokud jde o SNP IRF-5 rs10954213, bylo zjištěno, že genotyp A/G je poněkud častější u pacientů s MG než u kontrol (54,8 % oproti 45,5 %), ale analýza neodhalila žádný významný rozdíl (). Frekvence alel a genotypů obou variant IRF-5 jsou uvedeny v tabulce 2.

Frekvence genotypu TNFAIP3 rs13207033 G/G vykazuje zvýšení u zdravých kontrol (44,6 %) ve srovnání s pacienty s MG (33,3 %). Statistická analýza však neprokázala žádný významný rozdíl mezi oběma skupinami (). V případě kódujícího SNP rs2230926 jsou genotypy u 73 zkoumaných pacientů s MG a 81 kontrol rozloženy podobně, jak vyplývá z hodnoty . Frekvence genotypů varianty rs2230926, a to jak u pacientů s MG, tak u kontrol, jsou v souladu s frekvencemi získanými ze vzorků evropského původu (CEU), které jsou součástí mezinárodního projektu HapMap. Kromě toho naše studovaná skupina vykazovala frekvence genotypů rs13207033, které jsou srovnatelné s frekvencemi uváděnými v evropských populacích, v databázi dbSNP. Výsledky genotypizace obou variant TNFAIP3 jsou shrnuty v tabulce 3.

Věk začátku onemocnění byl rovněž hodnocen rozdělením pacientů s MG na pacienty s časným a pozdním začátkem onemocnění. Mezi oběma podskupinami a kontrolní skupinou nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v rozložení genotypů (údaje nejsou uvedeny).

Analýza sekvence DNA promotorové oblasti IL-10 ukázala, že genotyp ACC/GCC byl nejčastěji pozorovaným genotypem jak u pacientů s MG, tak u kontrol (23,72 %, resp. 28 %), následovaný genotypem s nízkou sekrecí ATA/ACC, který byl zjištěn u 21,62 % všech MG a 18 % kontrol (tab. 4). Současná studie však neodhalila žádný statisticky významný rozdíl v distribuci genotypu IL-10 mezi kompletní kohortou pacientů s MG (tj. celkovou MG) a kontrolní skupinou (). Srovnání podskupin podle věku při nástupu onemocnění ukázalo, že genotyp GCC/GCC s vysokou sekrecí IL-10 se vyskytuje v nízké frekvenci u MG s časným nástupem onemocnění (4 %), zatímco je nadměrně zastoupen u MG s pozdním nástupem onemocnění (20 %) (tab. 4). Byl zjištěn statistický trend asociace () mezi distribucí fenotypu IL-10 a oběma podskupinami s časným a pozdním nástupem (obr. 1).

Obrázek 1

Rozložení fenotypůIL-10 v podskupinách pacientů s časným a pozdním nástupem MG.

4. Diskuse

MG je heterogenní autoimunitní onemocnění s jasnou genetickou predispozicí. Kromě HLA lokusů bylo s náchylností k MG spojeno několik běžných variant v genech nespojených s HLA . Mnohé z těchto rizikových genů jsou široce rozšířeny mezi různými autoimunitními chorobami, což podporuje názor, že autoimunitní choroby jsou charakterizovány společnými patogenetickými cestami. V této studii jsme provedli asociační studii případů a kontrol s cílem prozkoumat podíl společných variant nacházejících se v genech IRF-5, TNFAIP3 a IL-10 na náchylnosti k MG. Tyto geny byly považovány za vhodné kandidáty vzhledem k jejich kritické roli v regulaci imunitní odpovědi a jejich již dříve známému podílu na autoimunitním procesu . Do genetické analýzy byli zahrnuti pouze pacienti s protilátkami proti AChR v séru, protože se předpokládalo, že představují homogennější podskupinu než širší skupina MG. Tato podskupina byla dále rozdělena na dvě odlišné jednotky onemocnění: pacienty s časným nástupem MG, zahrnující převážně ženy, a pacienty s pozdním nástupem MG, vykazující vyšší podíl mužů.

Pokud je nám známo, jedná se o první studii v jakékoli populaci, která zkoumala souvislost mezi MG a běžnými variantami genů IRF-5 a TNFAIP3. Podle předchozích studií, jejichž přehled je uveden v , bylo několik variant v lokusu IRF-5 reprodukovatelně spojeno se SLE, což implikuje IRF-5 jako gen náchylnosti k lupusu. Bylo zjištěno, že SNP rs10954213 ovlivňuje polyadenylaci mRNA, a tím zhoršuje hladiny proteinu IRF-5; homozygoti A/A exprimují přibližně 5krát vyšší hladiny imunoreaktivního IRF-5 ve srovnání s homozygoty G/G . Pokud jde o variantu rs60344245, delece 30 bp (GGCCGCCTACTCTGCAGCCGCCCACTCTGC/-) odstraňuje 10 aminokyselin z proteinu IRF-5 a mění doménu bohatou na prolin, kyselinu glutamovou, serin a threonin (PEST). V rodině proteinů IRF se tyto domény účastní proteinových interakcí a také způsobují rychlou proteolytickou degradaci . Navzdory jejich zjevné funkční roli současná studie neprokázala významnou asociaci variant IRF-5 rs10954213 a rs60344245 s MG ( a , resp. ), což naznačuje, že IRF-5 se nemusí podílet na patogenezi MG.

Nedávné výsledky studií GWA navíc odhalily významné asociace mezi variantami v lidském lokusu TNFAIP3 a širokým spektrem autoimunitních onemocnění. Skenování GWA pacientů s revmatoidní artritidou, s anticitrulinovanými peptidovými protilátkami, odhalilo silný důkaz asociace SNP rs13207033 s rozvojem RA . Podobně studie Musoneho a spolupracovníků uvádí asociaci nesynonymního kódujícího SNP, rs2230926 se SLE . Funkční studie k určení biologického dopadu rs2230926 prokázaly, že minoritní protein Cys127 vykazuje sníženou inhibiční aktivitu . Přesto byla pozorována absence asociace mezi MG a TNFAIP3 rs13207033 () a rs2230926 () SNP.

Všechny naše údaje mohou naznačovat, že orgánově specifická MG může mít odlišné genetické pozadí, které vede k jejímu oddělení od širokého shluku systémových autoimunitních onemocnění zahrnujících SLE a RA . Alternativní vysvětlení absence asociace v naší studii by mohlo souviset s nedostatečnou statistickou silou vzhledem k relativně malým velikostem vzorku. Jak je všeobecně známo, společné varianty představují jen malý podíl genetického rizika týkajícího se autoimunitních onemocnění. V takových případech může být zapotřebí tisíce vzorků, aby bylo možné odhalit asociační signál, který lze odlišit od šumu pozadí . U onemocnění s nízkou prevalencí, jako je MG, je však nábor velkých vzorků velmi obtížný. Za zmínku stojí, že diagnostické oddělení MG v řeckém Pasteurově institutu je jediným oddělením v Řecku, které systematicky přijímá a analyzuje krevní vzorky od roku 1983. Proto je naše sbírka vzorků DNA MG v současnosti největší v Řecku a je neustále obohacována o nové případy.

Přes specifický výběr pacientů s anti-AChR a jejich rozdělení na pacienty s časným a pozdním nástupem by navíc mohla být informativní další klasifikace podle anomálií brzlíku (thymom nebo hyperplazie); histologické údaje však nebyly k dispozici.

Nakonec neočekávaným výsledkem byla absence asociace SNP promotoru IL-10 s MG. Vzhledem k tomu, že se předpokládá, že tyto varianty leží v promotorové oblasti IL-10, mohou ovlivňovat vazbu transkripčních faktorů, které regulují expresi IL-10. Nedávná studie Alsetha a spolupracovníků, provedená na norské populaci, odhalila asociaci genotypu ACC/ACC s podskupinou pacientů s pozitivními titanovými protilátkami u MG, zatímco statisticky významně zvýšená frekvence ATA/ATA byla pozorována u pacientů s časným nástupem MG . V naší skupině řeckých případů MG nebyl zjištěn žádný důkaz asociace, když jsme porovnali rozložení genotypů mezi kompletní kohortou pacientů s MG a kontrolní skupinou (). GCC/GCC genotyp však odhalil statistický trend asociace s MG, a to v odlišných podskupinách pacientů s časným a pozdním nástupem MG (). Další studie na větších vzorcích by tedy mohly odhalit možné souvislosti MG s IL-10. Za zmínku stojí také skutečnost, že frekvence alel pro daný SNP se mohou v různých etnických skupinách značně lišit. Rozdíl zaznamenaný ve frekvenci genotypu ACC/ACC mezi norskou a helénskou kontrolní skupinou (3,4 % versus 15 %) tento stav odráží.

Celkově se jedná o první snahu, pokud je nám známo, zabývat se možnou asociací mezi běžnými genetickými variantami IRF-5 a TNFAIP3 a genetickým základem MG, a to v jakékoli populaci, zatímco k odhalení dosud z velké části neznámého genetického pozadí MG jsou zapotřebí další studie.

Poděkování

Autoři děkují pacientům s MG a dobrovolníkům, kteří se zúčastnili naší studie. Anně Kokla a Marii Belimezi z řeckého Pasteurova ústavu děkujeme za pomoc při sběru vzorků pacientů s MG. Tato studie byla finančně podpořena granty Evropské komise Fight MG pro S. J. Tzartose a GEN2PHEN (FP7-200754) pro G. P. Patrinose, za účasti finančních prostředků z projektu Thales (Autoimmunity) pro S. J. Tzartose a K. Poulase a projektu Hellas/Turkey Bilateral Collaboration (MuSK-myasthenia gravis) pro K. Poulas.

Doplňkové materiály

Doplňkové materiály obsahují Doplňkovou tabulku 1, která poskytuje informace o primerech pro PCR amplifikaci jednotlivých variant a jejich doprovodné sekvence.

1. Doplňková tabulka

.