Apoenzym

5.11.3 Úloha bílkoviny – interakce mezi enzymem, koenzymem a substrátem

Ve všech případech se koenzym váže na apoenzym bez výrazné změny absorpčního spektra. Toto pozorování naznačuje, že enzym nedeformuje korrinový kruh z jeho roztokové konformace v základním stavu. Z UV-viditelného absorpčního spektra komplexu koenzym-protein však nejsou k dispozici žádné informace o identitě α-osového ligandu. Studie ukázaly, že α-osový 5,6-dimethylbenzimidazolový ligand je nahrazen histidinovým postranním řetězcem z příslušného proteinu nejméně u tří enzymů závislých na kobalaminu: methioninsyntázy,4,7 methylmalonyl-CoA mutázy8,45,46 a glutamátmutázy47. Naproti tomu 5,6-benzimidazolový ligand z kobalaminu stále zaujímá pozici α-osového ligandu v AdoCbl vázaném na dioldehydrasu48 a ribonukleotidreduktasu (viz kap. 5.08).

Pro koordinaci histidinového postranního řetězce se musí „nukleotidová smyčka“ báze 5,6-dimethylbenzimidazolu, ribofuranosylfosfodiesteru a propionamidového postranního řetězce vychýlit od korrinového kruhu a zasunout se do vazebné kapsy uvnitř proteinu. Konsenzuální sekvence DxHxxG byla identifikována u enzymů závislých na kobalaminu, které nahrazují postranní řetězec histidinu za α-osový ligand.7,49,50 Histidin, který se koordinuje s atomem kobaltu, zcela jistě interaguje s aspartátovým zbytkem prostřednictvím vodíkové vazby. Kromě role koordinačního ligandu není zatím přesná funkce dyády His/Asp jako modulátoru enzymatické aktivity jasná.49 I další zbytky v aktivním místě se mohou podílet na rozšířené síti vodíkových vazeb, která řídí reaktivitu v kovovém centru.7

Adenosylkobalamin-dependentní enzymy musí zvýšit rychlost homolýzy vazby CoC nejméně 1012krát, aby bylo dosaženo pozorované rychlosti katalýzy.14 Labilizace adenosylkobalaminu vyžaduje oslabení vazby CoC, aby bylo možné homolytické štěpení. Ačkoli tento koncept není u enzymů závislých na kobalaminu prokázán, dostatečná energie k narušení (oslabení) vazby CoC by mohla snadno pocházet z využití přebytečné vazebné energie, která pochází z vícenásobných interakcí vodíkových vazeb na kobalaminový kofaktor, včetně amidových postranních řetězců, které zdobí korrinový kruh.51 Amidové postranní řetězce jsou také důležitými rozpoznávacími prvky pro vazbu na neenzymatické kobalaminové transportní proteiny transkobalamin, haptokorin a vnitřní faktor.52 Odstranění nebo chemická derivatizace specifických amidových postranních řetězců mění vazbu na transkobalamin 3-40krát52 a úplné odstranění c-amidového postranního řetězce umožňuje zavedení další dvojné vazby v makrocyklickém skeletu, čímž dochází ke zploštění korrinového kruhu s doprovodným červeným posunem absorpčního maxima.53

Kromě podpory požadované reakce plní enzymy závislé na adenosylkobalaminu druhou důležitou funkci tím, že zabraňují nežádoucím vedlejším reakcím, které často doprovázejí radikálové reakce.54 Tato funkce negativní katalýzy54 vyžaduje vysoce omezený povrch volné energie, který si lze představit jako hluboký kaňon, jímž reakce postupuje po povrchu volné energie. Tento kaňon musí mít strmé stěny, které zabraňují vedlejším reakcím a omezují vysoce reaktivní radikálový meziprodukt. Na konci reakční sekvence je radikálový meziprodukt zhášen rekombinací 5′-deoxyadenosylového radikálu a kob(II)alaminu, čímž se regeneruje základní stav (klidový stav) adenosylkob(III)alaminového kofaktoru. Jestliže enzym investuje 25 kcal mol-1 na podporu homolýzy vazby C-Co na začátku katalytického cyklu, musí být tato energie na konci reakční sekvence obnovena. Obnovení energie by nebylo možné, pokud by došlo k nežádoucí sekvenci přeskupení za vzniku radikálu, který je termodynamicky stabilnější než 5′-deoxyadenosylový radikál. Proto musí enzym zabránit přeskupení alkylového radikálu na nízkoenergetický meziprodukt nebo migraci přes bílkovinný lešení za vzniku stabilního radikálu, který se nemůže účastnit katalýzy.55

Paramagnetický druh se nevytvoří, dokud nejsou v komplexu enzym-substrát přítomny všechny reakční složky, protože tvorba radikálu odvozeného od koenzymu v nepřítomnosti substrátu by mohla vést k nežádoucím vedlejším reakcím. EPR experimenty s methylmalonyl-CoA mutasou46,55 potvrzují, že k homolýze vazby CoC dochází až po přidání substrátu, jak naznačuje výskyt EPR signálu podobného produktu.46 Podobně spektrofotometrické experimenty se zastaveným průtokem s ethanolamin amoniak lyasou ukazují, že podpis kob(II)alaminu se objeví ve viditelném spektru až po spojení enzymu a koenzymu s nasycením substrátem56.-59

Fotolýza, termolýza a enzymem podporovaná homolýza vazby CoC adeno- sylkobalaminu vede ke vzniku singletového radikálového páru tvořeného kob(II)alaminem a 5′-deoxyadenosylovým radikálem.60,61 Protože všechny tyto procesy vedou ke vzniku stejného radikálového páru, lze informace z reakční dynamiky studií fotolýzy vztáhnout k navrhovaným mechanismům enzymových reakcí. Fotohomolýza adenosylkobalaminu začíná elektronickou propagací π → π* v korrinovém kruhu a musí zahrnovat přechodný stav přenosu náboje na cestě k homolýze vazby CoC.60,61 Pikosekundové fotolýzové studie adenosylkobalaminu ukazují rychlost rekombinace geminátových radikálových párů 109 s-1 s frakční účinností rekombinace v kleci, Fc, přibližně 94 %42,62-64. Nanosekundové a kontinuální fotolýzové studie kobalaminů potvrzují účinnou rekombinaci radikálových párů v geminátové kleci s celkovým fotochemickým kvantovým výtěžkem přibližně 20 % pro adenosylkobalamin a 35 % pro methylkobalamin65,66 . V nepřítomnosti enzymu rekombinuje velká část geminátových radikálových párů dříve, než dojde k významnému difúznímu oddělení. Aby se stabilizoval 5′-deoxyadenosylový radikál a podpořila se katalýza, musí enzym zvětšit vzdálenost oddělování radikálových párů, pravděpodobně konformační změnou. Ať už je mechanismus jakýkoli, vysoká rychlost rekombinace geminátů v radikálovém páru vyžaduje, aby jednou z funkcí enzymu bylo oddělit radikály nebo dočasně zachytit jeden z radikálů, aby se zabránilo předčasné rekombinaci.

Ačkoli výsledný singletový {5′-deoxyadenosylový radikál:kob(II)alamin} radikálový pár má identické elektronické stavy,59-61,67 enzymatická homolýza vazby CoC nemá přístup k excitovanému elektronickému stavu a musí začít jiným procesem, který oslabí vazbu CoC a posune rovnováhu směrem k disociaci (viz oddíl 5.11.2). Štěpení vyvolané napětím bude mít za následek nejen homolýzu vazby CoC, ale tento proces také zvýší vzdálenost separace radikálových párů, pokud složka distorze probíhá podél apikální osy kobaltu. Tento brutální přístup k natahování vazby CoC může být nejúčinnější metodou k dosažení jak homolýzy, tak čistého snížení rychlosti rekombinace radikálových párů.

Je také možné, že enzym posílí vazbu CoC a znevýhodní homolýzu stlačením apikální interakce Co-α-N.

. Byly studovány termodynamické vlastnosti adenosylkobinamidových analogů + a +.68 Silnější vazba CoC byla pozorována u + s kratší vzdáleností vazby CoN ve srovnání s pyridinem jako α-osovou bází. Silnější vazba CoC vede k výraznému posunu směrem k heterolýze jako preferované cestě. V tomto modelovém systému musí zkoumaný enzym, methylmalonyl-CoA mutasa, buď zabránit heterolýze CoC, nebo sledovat heterolytickou cestu.68

V methioninsyntáze je korinová část kobalaminu vložena mezi dvě domény fragmentu o velikosti 27 kDa, přičemž nukleotidový ocas proniká do hluboké kapsy tvořené zbytky C-koncové domény.7,69,70 Tato sekvence obsahuje oblast s mírnou hydrofobností, která je lemována prodlouženými hydrofilními segmenty.71 Mezi doménami, které se stýkají s korrinovým kruhem, se očekává strukturní podobnost. Doména α/β, která se váže na spodní polovinu korrinového kruhu a pojme prodloužený nukleotidový chvost (fosfodiesterovou část a 5,6-dimethylbenzimidazolovou skupinu) u methionin syntázy a methylmalonyl-CoA mutázy, se očekává také u glutamát mutázy (vide infra).

.