CHAPTER 1

EtsuoNiki*a e KouichiAbeb
a University of Tokyo, Research Center for Advanced Science and Technology (RCAST), Komaba, Tokyo 153-8904, Japão. E-mail: [email protected]
b Laboratórios SSCI, Faculdade de Farmacologia, Universidade de Musashino, Nishi-Tokyo-Shi, Tóquio 202-0023, Japão.

Vitamina E é o nome coletivo dos compostos lipofílicos naturais cuja estrutura molecular é composta por um anel de cromanol com uma cadeia lateral localizada na posição C2 e inclui quatro tocoferóis e quatro tocotrienóis. A vitamina E, descoberta como um factor dietético essencial para uma reprodução normal, é agora aceite como um importante antioxidante de absorção de radicais livres em humanos e protege as moléculas biológicas de modificações oxidativas prejudiciais. As estruturas e propriedades dos homólogos da vitamina E e suas fontes, funções e aplicações são resumidas.

1.1 Introdução

Em 1922, Evans e Bishop demonstraram a existência de um fator dietético até então não reconhecido como essencial para a reprodução normal no rato.1 Aceitou-se na época que a função mais marcante da vitamina E era proporcionar uma gestação normal em um rato grávido para evitar a reabsorção dos embriões que invariavelmente ocorria em sua ausência.2 Este fator dietético desconhecido X estava presente em alface verde, folhas secas de alfafa, trigo e aveia. Evans isolou o fator X do óleo de gérmen de trigo, forneceu a fórmula química C29H50O2 e propôs o nome α-tocopherol em 1936.3 A fórmula estrutural do α-tocopherol foi fornecida por Fernholz em 1938.4 Tocotrienóis foram descobertos muito mais tarde que o tocoferol e nomeados no início dos anos 60.5,6

Olcott descobriu que as frações lipídicas dos óleos vegetais continham antioxidantes contra a deterioração oxidativa da banha.7 Desde então, tem sido inequivocamente demonstrado que a vitamina E atua como um antioxidante essencial in vivo, bem como in vitro e desempenha um papel importante na prevenção de danos oxidativos prejudiciais das moléculas biológicas.8-11 Mais recentemente, as funções não-antioxidantes da vitamina E, incluindo sinalização celular, regulação gênica, processos de membrana e funções nervosas, também receberam muita atenção.12-14 No entanto, muitas questões ainda são controversas e ainda precisam ser elucidadas. Informações sólidas baseadas em evidências químicas sólidas são essenciais para entender o papel da vitamina E in vivo, bem como in vitro.

1.2 Homólogos: Nomenclatura e Estrutura

Vitamina E é uma substância lipossolúvel, derivada de plantas, cuja estrutura molecular é composta por um anel de cromanol com uma cadeia lateral localizada na posição C2. A vitamina E refere-se a um grupo de oito compostos diferentes: α-, β-, γ-, e β-tocoperóis e os quatro tocotrienóis correspondentes. Os quatro tocoferóis têm uma cadeia lateral saturada de fitotilo, enquanto os tocotrienóis têm uma cadeia lateral insaturada de isoprenil contendo três ligações duplas em C3′, C7′, e C11′. As ligações duplas das cadeias laterais dos tocotrienóis em C3′ e C7′ têm uma trans-configuração. As formas α-, β-, γ- e δ diferem quanto ao número e posição dos grupos metílicos no anel do cromanol. As formas α de tocoferol e tocotrienol têm três grupos metílicos nas posições C5, C7 e C8 do anel de cromanol, enquanto as formas β- e γ têm duas e as formas δ têm um grupo metílico como ilustrado na Figura 1.1.

Além dos tocoferóis e tocotrienóis, também foram encontrados na natureza tocomonoenóis e tocodienóis contendo uma e duas insaturações de dupla ligação, respectivamente. Por exemplo, um tocomonoenol com uma única dupla ligação ao carbono 11′, 2,5,7,8-tetrametil-1-2-(4′,8′,12′-trimetiltrideca-11′-enil)-6-cromanol, foi isolado dos óleos de palma e farelo de arroz.15 Desde então, vários grupos detectaram tocomonoenóis em plantas e alimentos vegetais, tais como α-tocomonoenol em óleo de palma,16-22 óleo de semente de abóbora (Cucurbita pepo L.),23 e óleo de girassol (Helianthus annuus),24 γ-tocomonoenol em óleo de semente de abóbora,22,23 β-tocomonoenol em kiwi (Actinidia chinensis),25 e β-, γ-, e δ-tocomonoenol nas folhas de Kalanchoe daigremontiana e Phaseolus coccineus.26 Um tocomonoenol com insaturação na extremidade da cadeia isoprenoidal também foi encontrado nos tecidos do salmão.27 Além disso, foram identificados tocodienóis com duas ligações duplas no carbono 7′ e 11′ em óleo de palma.16,21

Tocoferóis contêm três carbonos quirais, um em C2 no anel de cromanol e dois na cadeia lateral em C4′ e C8′. Ocorre naturalmente α-tocopherol contém carbonos quirais na formação R, 2R, 4′R e 8′R-α-tocopherol. α-Tocotrienol tem um centro quiral em C2 no anel de cromanol e os tocotrienóis naturais ocorrem como o R-isoform. Por outro lado, a síntese química do α-tocopherol produz uma mistura equimolar de oito estereoisómeros diferentes: RRR, SRR, RSR, RRS, RSS, SSR, SRS, e SSS. O sintético α-tocopherol é chamado de all-rac-α-tocopherol. Uma mistura equimolar de RRR-α-tocopherol e SRR-α-tocopherol é chamada 2-ambo-α-tocopherol. Os nomes IUPAC de RRR-α-tocopherol e RRRR-α-tocotrienol são (2R)-2,5,7,8-tetrametil-2-croman-6-ol e (2R)-2,5,7,8-tetrametil-2–3,4-dihidrocromo-6-ol, respectivamente.

Foram preparadas formas de ésteres de tocoferol e tocotrienóis, incluindo acetato, nicotinato, succinato e fosfato, e sua ação e aplicações potenciais foram estudadas. A vitamina E é facilmente oxidada quando sujeita a condições de calor, luz e alcalinas, mas os ésteres são menos susceptíveis à oxidação e, portanto, mais apropriados para aplicações alimentícias, cosméticas e farmacêuticas, em comparação com a forma livre. Os conjugados de polietilenoglicol de tocoferóis e tocotrienóis têm a capacidade de formar micelas miscíveis na água devido às propriedades anfifílicas e melhorar a biodisponibilidade em animais e humanos através da melhoria da sua solubilidade e absorção de água.28 Foi relatado que o succinato de RRR-α-tocoferil polietilenoglicol 1000 atuou como uma forma segura e eficaz de vitamina E para reverter ou prevenir a deficiência de vitamina E durante a colestase infantil crônica.29

1.3 Propriedades físico-químicas

Os tocoferóis são óleos viscosos à temperatura ambiente, insolúveis em água, mas solúveis em etanol e solventes aprox. A vitamina E é um óleo ligeiramente amarelo a âmbar, quase inodoro, claro e viscoso, que escurece com a exposição ao ar ou à luz por oxidação. As propriedades físico-químicas do α-tocopherol, a forma mais abundante e ativa da vitamina E em humanos, estão resumidas na Tabela 1.1.30 O ponto de fusão do RRR-α-tocopherol é de 3 °C. As rotações ópticas dos tocoferóis são muito pequenas e dependem da natureza do solvente. Os espectros de absorção ultravioleta de tocoferóis e tocotrienóis em etanol mostram um máximo de absorção a 292-298 nm, enquanto os espectros infravermelhos mostram um alongamento OH (2,8 ± 3,0 µm) e CH (3,4 ± 3,5 µm) e uma banda característica a 8,6 µm. α-Tocoferol é fluorescente com uma emissão máxima de cerca de 325 nm numa solução hidrofóbica. A energia de dissociação de ligação da ligação O-H do α-tocopherol é 77,1 kcal mol-1,31 Os valores de pKa para α-, β-, γ- e β-tocopherol em solução micelar foram relatados como 13,1, 12,8, 12,7 e 12,6 respectivamente.32

O coeficiente de partição do α-tocoferol é 12,2, enquanto que para o ácido ascórbico é -1,85,30 mostrando seus caracteres lipofílicos e hidrofílicos, respectivamente.

1,4 Fontes

Numerosos alimentos fornecem vitamina E. Sementes e frutas estão entre as melhores fontes de vitamina E. Vegetais de folhas verdes também são fontes importantes. Apenas plantas e organismos fotossintéticos são capazes de sintetizar vitamina E.33,34 A síntese é facilitada pelas enzimas para produzir tocoferóis estereoespecíficos: RRR-tocoferóis.35 Tocoferóis e tocotrienóis podem ser extraídos e purificados ou concentrados a partir de óleos vegetais e outros materiais vegetais superiores. Os suplementos dietéticos são outra fonte de vitamina E. A maioria dos suplementos de vitamina E contém quantidades substancialmente mais elevadas de vitamina E do que os alimentos. A vitamina E em suplementos dietéticos e alimentos fortificados é frequentemente esterificada para prolongar a sua vida útil enquanto protege as suas propriedades antioxidantes.

O conteúdo e composição de tocoferóis e tocotrienóis em óleos naturais variam marcadamente entre as espécies vegetais e mesmo dentro da mesma espécie. Os tocoferóis são amplamente distribuídos em plantas superiores, enquanto que os tocotrienóis ocorrem apenas em alguns tecidos não fotossintéticos. Alguns exemplos do conteúdo em óleos naturais comestíveis adotados em vários relatórios36-41 são mostrados na Tabela 1.2. α-Tocoferol é o principal tocoferol em óleos de palma, oliveira e girassol, enquanto o conteúdo de γ-tocoferol em alguns óleos comestíveis como milho, colza e soja é maior que α-tocoferol.

As principais fontes de tocotrienóis são palma, arroz e anato, sendo a proporção de tocoferol-tocotrienol em cada uma de 25 : 75, 50 : 50, e 0,1 : 99,9, respectivamente.42 O óleo de palma contém quantidades consideráveis de α-, γ-, e δ-tocotrienols. γ-Tocotrienol é a principal isoforma de vitamina E no óleo extraído do farelo de arroz39,43 enquanto β-tocopherol é uma das principais isoformas encontradas no óleo de germe de trigo.36,37 Curiosamente, a fração lipídica das sementes de anato (Bixa orellana L.) continha apenas tocotrienóis, principalmente o β-tocotrienol, mas não tocoferóis.44

1,5 Síntese Química

Devido às amplas aplicações nas indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética, cerca de 35 000 toneladas de vitamina E são fabricadas por ano em todo o mundo.45 O TOCOCOCOFEROL, all-racemic-α, all-rac-α-tocopherol, uma mistura equimolar de todos os oito estereoisômeros, é industrialmente o produto mais importante e é preparado por síntese total ou tem origem em fontes naturais. É aplicado principalmente como um éster de acetato. A síntese industrial consiste em três partes principais: a preparação da 2,3,5-trimetilidroquinona, a produção do componente da cadeia lateral e a reação de condensação.45

Puro RRR-α-tocoferol é preparado quimicamente por semi-síntese. Óleos vegetais refinados em grande escala e isolados por uma combinação de vários métodos de separação contêm misturas de RRR-α-tocoferol, que são convertidas em RRR-α-tocoferol através de reações de permetílação. Os esforços e estratégias para sintetizar tocoferóis e tocotrienóis foram descritos em detalhes.45

1.6 Análise

Produtos naturais contêm misturas de tocoferóis e tocotrienóis isoméricos juntamente com pequenas quantidades de tocomonoenóis e tocodienóis. Eles são metabolizados e oxidados para produzir muitos tipos de compostos. As amostras biológicas contêm misturas complicadas de isoformas de vitamina E e seus metabólitos e produtos de oxidação. A identificação e quantificação de isoformas de vitamina E e seus produtos são importantes para elucidar o seu papel e funções. A preparação das amostras é o passo mais demorado e importante na análise, pois é a principal fonte de erros. Muitos métodos analíticos incluindo colorimétricos, fluorométricos, cromatográficos de gás (GC), cromatográficos líquidos de alto desempenho (HPLC),46 GC-MS,47 e HPLC-MS47,48 foram relatados (ver também Capítulo 2). Em relação aos documentos públicos para o método de determinação quantitativa da vitamina E em princípios farmacêuticos activos, os Estados Unidos e a Farmacopeia Europeia adoptam o método GC, enquanto a Farmacopeia Japonesa adopta o método HPLC. Cada um destes métodos tem os seus méritos e deméritos. Atualmente, os métodos HPLC são os mais amplamente aplicados.

As condições HPLC para análise da vitamina E foram resumidas em várias revisões.46,47,49,50 A vitamina E e os produtos são obtidos de produtos naturais, matrizes alimentares e amostras biológicas por extração direta, extração em fase sólida e saponificação. Deve-se tomar cuidado para evitar a oxidação e decomposição dos artefatos durante a preparação das amostras e análises. O uso de detecção eletroquímica (amperométrica), fluorométrica (Ex. 290-295 nm, Em. 320-330 nm), ou de EM é muito mais sensível e específica do que a detecção UV convencional. Tocol, 2-metil-2-(4,8,12-trimetiltridecil)-6-cromanol, pode ser o melhor composto para ser usado como padrão interno, pois suas características são semelhantes às da vitamina E. O acetato de de deutério, marcado com α-tocoferol, é comumente usado como padrão na análise da EM. Na maioria das análises de vitamina E, a ionização química por pressão atmosférica (APCI) é usada no modo de ionização positiva. Pode-se notar que a cromatografia de superfluidos usando CO2 e etanol como fase móvel, NH2 como fase estacionária e espectrometria de massa para a detecção e quantificação de homólogos de vitamina E tem sido proposta como estratégia analítica “mais verde”.51,52

1,7 Funções e Aplicações

A vitamina E é um micronutriente fisiologicamente essencial e tem sido aplicada em vários campos, incluindo medicina, produtos farmacêuticos, cosméticos e alimentos. Presume-se que a vitamina E desempenha um papel importante na promoção da saúde e na prevenção e/ou tratamento de algumas doenças e distúrbios. A dose diária recomendada é de 15 mg (22,4 UI, Unidade Internacional) para adultos.

Foram demonstradas ou propostas múltiplas funções da vitamina E, incluindo (1) antioxidante através da remoção de radicais livres, especialmente radicais peroxil, e oxigênio simples, (2) estabilização da membrana através da formação de complexos com moléculas desestabilizantes de modo a evitar perturbações do equilíbrio anfíptico dentro da estrutura, (3) regulador fisiológico da atividade enzimática, sinalização celular, proliferação celular e expressão gênica, que não está diretamente relacionada à ação antioxidante, (4) inibição da coagulação plaquetária, (5) prevenção de doenças incluindo distúrbios neurológicos, doenças cardiovasculares, danos oculares e cutâneos relacionados à idade, e infertilidade, e (6) modificador biocompatível de biomateriais e dispositivos médicos, por exemplo, em polietileno de alto peso molecular usado em implantes de quadril e joelho. Tem sido argumentado que os tocotrienóis possuem efeitos positivos adicionais à saúde além dos dos tocoferóis, incluindo, por exemplo, indução de respostas imunológicas e redução dos níveis séricos de colesterol.53-55

Entre essas funções, o papel da vitamina E como um antioxidante contra a peroxidação lipídica mediada por radicais livres tem sido inequivocamente demonstrado e parece que esta é a função fisiológica mais importante desta vitamina. A vitamina E também inibe a oxidação do ar de alimentos, óleos e materiais industriais para prolongar a sua vida útil. O significado fisiológico de outras funções que não estão relacionadas à função antioxidante deve ser estabelecido em um estudo futuro.

A vitamina E é amplamente utilizada como um suplemento dietético, por si só ou em conjunto com outros micronutrientes, como a vitamina C, para promover a saúde e para reduzir o risco ou prevenir doenças que se supõe serem decorrentes da modificação oxidativa prejudicial das moléculas biológicas. A vitamina E é utilizada para fortalecer alguns alimentos e bebidas.

A deficiência de vitamina E é incomum, uma vez que as dietas típicas parecem fornecer quantidades suficientes, embora a desnutrição e os distúrbios genéticos possam resultar em deficiência de vitamina E. Os bebés prematuros de peso muito baixo podem ter deficiência de vitamina E. Além disso, as pessoas com distúrbios de absorção de gordura56 e distúrbios hereditários em que a proteína de transferência de toxina do fígado α-tocopherol (α-TTP) é defeituosa ou ausente57 ou há diminuição dos níveis de selenoproteínas58 são mais susceptíveis de se tornarem deficientes em vitamina E e requerem doses elevadas de vitamina E suplementar.

O papel potencial da vitamina E contra doença periodontal,59 esteato-hepatite não alcoólica,60 e sarcopenia61 tem recebido atenção. A ingestão insuficiente de micronutrientes (vitaminas e fósforo) foi significativamente associada à gravidade da doença periodontal.62 Uma revisão sistemática mostrou melhora significativa dos parâmetros periodontais pela vitamina E e licopeno.63 A vitamina E pode mitigar a disfunção esquelética associada ao envelhecimento e melhorar a regeneração muscular, atenuando assim a sarcopenia.64

Vitamina E também é utilizada para materiais biomédicos. α-Tocoferol é misturado a uma membrana de diálise para o manejo clínico de pacientes com hemodiálise crônica para melhorar a estabilidade e as funções.65 A vitamina E misturada com polietileno de ultra-alto peso molecular (UHMWPE) foi desenvolvida como material para uso em próteses totais de joelho e quadril.66 α-Tocoferol é aceito para melhorar a resistência à oxidação, mantendo a resistência ao desgaste e à fadiga.

A baixa solubilidade em água da vitamina E tem limitado muito a sua aplicação. Investigações para melhorar o encapsulamento oral e tópico e formulações de vitamina E têm sido amplamente realizadas e vários sistemas de administração de vitamina E têm sido desenvolvidos para superar este problema e melhorar a solubilidade, permeação e biodisponibilidade. Lipossomas,67 nano-emulsões e nanopartículas lipídicas68 são alguns exemplos.69 O éster tocoferílico de polietilenoglicol e o fosfato tocoferílico são solúveis em água. Os conjugados de polietileno de tocotrienóis também têm sido estudados.28

Polifenóis dietéticos como a quercetina são convertidos em glicosídeos e/ou derivados de sulfato, ou seus derivados de O-metil, durante a absorção pelo organismo, e se apresentam como estes metabólitos conjugados no sangue circulante. A formação dos metabólitos do tocoferol, como glucosídeo, sulfato e derivados do O-metilo in vivo não foi relatada, mas α-tocoferol glucosídeo foi sintetizado de 2-hidroximetil-2,5,7,8-tetrametilcromano-6-ol e maltose por transglicosilação com α-glucosidase da espécie Saccharomyces.70 O produto glicosilado, 2-(α-d-glucopiranosil)metil-2,5,7,8-tetrametilcromano-6-ol, é solúvel em água e age como um antioxidante radical de limpeza.70,71 δ- O glucosídeo tocoferol foi preparado e seus efeitos durante sua aplicação tópica na pele foram estudados.72

Uma questão importante é se cada isoforma de vitamina E exerce ou não sua função específica que não é compartilhada com outras isoformas. Tem sido argumentado que o tocotrienol exerce algumas funções que o tocoferol não exerce, e que o tocoferol interfere com tais funções.42 Estas questões importantes devem ser esclarecidas em estudos futuros.

1.8 Estabilidade

A vitamina E é estável à temperatura ambiente, mas é prontamente oxidada a alta temperatura, sob luz ou em meio alcalino. A fritura é um dos métodos mais comuns de preparação de alimentos e durante o processo de fritura, geralmente entre 160-190 °C, a vitamina E é oxidada para dar misturas complicadas de produtos, incluindo tocados (5,6-tocopheryldione) e dímeros que se assume serem formados por uma recombinação de radicais tocoferoxil. α-Tocoferol é oxidado para α-tocopheroxyl radical por íons metálicos de transição como íons férricos (Fe3+) e cupricos (Cu2+).