Carga de Espaços Perivasculares Dilatados, um Marcador Emergente de Doença Cerebral de Pequenos Vasos, É Altamente Hereditário

Introdução

Espaços Perivasculares (PVS), também chamados espaços Virchow-Robin, são estruturas fisiológicas normais preenchidas com líquido tipo ressonância magnética cerebrospinal e revestidas por células piais, circundando a parede das artérias, arteríolas, veias e vênulas à medida que penetram no parênquima cerebral. A PVS pertence ao sistema linfático e está envolvida na depuração de resíduos, fornecimento de substrato energético e regulação do fluxo sanguíneo.1,2 Sob certas circunstâncias, tais como idade crescente e doença cerebral de pequenos vasos (DVC), a PVS pode dilatar (espaço perivascular dilatado) e tornar-se detectável na RM do cérebro.3-7 Os mecanismos subjacentes a esta dilatação, possivelmente refletindo a redução da depuração linfática, são especulativos.1 A dPVS mostrou estar fortemente correlacionada com outros marcadores de RM de cSVD, tais como volume de hiperintensidade da matéria branca (WMHV), infartos cerebrais lacunares (LI) e microbleeds cerebrais.3-6,8 Mostramos anteriormente que altos graus de DVPVD em gânglios basais (BG) ou matéria branca (WM) estão associados ao aumento do risco de demência incidente, independentemente de outros marcadores de RM de DVPc, em pessoas mais idosas da comunidade.9

Determinantes de DVPc são mal compreendidos. Os principais fatores de risco conhecidos são idade e hipertensão arterial, sendo esta última mais fortemente associada à DSVD no GB. A identificação dos determinantes genéticos da SVP pode fornecer pistas importantes sobre os mecanismos moleculares subjacentes e sobre a patofisiologia da DVBc e da demência. Procuramos examinar a contribuição genética para a carga da DSVP medindo sua hereditariedade e compartilhando a hereditariedade com outros marcadores de RM do DSVC no estudo populacional Three City (3C) Dijon Study.

Métodos

Os dados que suportam os achados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação razoável.

População estudantil

O Estudo 3C-Dijon é um estudo de coorte baseado na comunidade, compreendendo 4931 participantes não institucionalizados, com idade entre 1999 e 2001, selecionados aleatoriamente das listas eleitorais da cidade de Dijon.10 Os participantes com idade <80 anos e inscritos entre junho de 1999 e setembro de 2000 (n=2763) foram convidados a fazer uma ressonância magnética cerebral. Embora 2285 participantes (82,7%) concordaram em participar devido a limitações financeiras, as ressonâncias magnéticas foram realizadas apenas em 1924 participantes. Entre estes, 1683 também tinham sido submetidos a genotipagem de todo o genoma. Após a exclusão de indivíduos com tumor cerebral (n=8), acidente vascular cerebral (n=71), ou demência (n=7) na linha de base, a amostra restante era composta de 1597 participantes. Avaliação visual e quantificação estava disponível em 1559 participantes para dPVS e 1562 participantes para LI (35 indivíduos com infarto cerebral não-lacunar foram excluídos); e 1495 participantes tinham medidas quantitativas automatizadas do WMHV. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Kremlin-Bicêtre. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito.

Genótipo

Amostras de DNA de participantes do 3C-Dijon foram genotipadas com Illumina Human610Iquad BeadChips no Centre National de Génotypage, Evry, França.

Genotipagem foi realizada em 4263 participantes, dos quais 186 foram excluídos após o controle de qualidade (Métodos no Suplemento de Dados on-line), deixando um total de 4077 participantes. Os primeiros 20 componentes principais (PCs) para a amostra 3C-Dijon foram gerados usando EIGENSOFT e usados para corrigir a estratificação de ancestralidade da população (Métodos no Suplemento de Dados online-only Data Supplement). Os genótipos foram imputados ao painel de referência 1000 Genomes fase I versão 3 (todas as etnias) usando MaCH 1.0, após a aplicação de procedimentos padrão de controlo de qualidade (Métodos no Suplemento de Dados online-only). No total, 11 572 501 polimorfismos de nucleotídeos simples (SNPs) foram disponibilizados para análise após controle de qualidade.

MRI Aquisição

Rating of dPVS

dPVS foram avaliados por um leitor experiente (Y.-C.Z.) e quantificados em uma escala semiquantitativa. Foram definidas como lesões de sinal tipo líquor (hipointensas em T1 e hiperintensas em T2) de forma redonda, ovóide ou linear com diâmetro máximo <3 mm, com contornos lisos delineados, e localizadas em áreas supridas por artérias perfurantes. As lesões que preenchem os mesmos critérios, excepto o diâmetro ≥3 mm, foram cuidadosamente examinadas nos 3 planos (forma, intensidade do sinal) para as diferenciar do LI e da hiperintensidade de matéria branca (WMH). Somente as lesões com forma vascular típica e as que seguiram a orientação dos vasos perfurantes foram consideradas dPVS.3 No BG e WM, que são os locais com maior densidade de dPVS, a fatia contendo o maior número de dPVS foi utilizada para a classificação.3

No BG, os dPVS foram classificados usando uma pontuação de 4 graus: grau 1 para <5 dPVS, grau 2 para 5 a 10 dPVS, grau 3 para >10 dPVS mas ainda numerável, e grau 4 para inúmeros dPVS resultando em uma mudança de cribriforme no BG (Figura). No WM, os dPVS também foram classificados usando uma pontuação de 4 graus: grau 1 para <10 dPVS no WM total, grau 2 para >10 dPVS no WM total e <10 na fatia contendo o maior número de dPVS, grau 3 para 10 a 20 dPVS na fatia contendo o maior número de dPVS, e grau 4 para >20 dPVS na fatia contendo o maior número de dPVS (Figura).3 No hipocampo e no tronco encefálico, os dPVS foram dicotomizados como presença de ≥1 dPVS versus nenhum. Uma variável de carga global do dPVS foi construída pela soma dos graus de dPVS no BG e WM e adicionando 1 ponto para a presença de ≥1 dPVS no hipocampo e 1 ponto para a presença de ≥1 dPVS no tronco encefálico. Devido ao pequeno número de participantes nas categorias mais altas, estes foram combinados (pontuação global ≥8). A variável global foi normalmente distribuída na inspeção visual (Métodos no Suplemento de Dados on line).

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Outras medidas de RM

Foi utilizado um procedimento automatizado e validado para localizar e medir o WMHV.11 Dois subgrupos de WMH foram definidos: WMH periventricular (pvWMH) quando a distância ao sistema ventricular era <10 mm e WMH profundo, caso contrário. As ICVs foram avaliadas visualmente pelo mesmo avaliador (Y.-C.Z.) que as SVPVD e foram definidas como lesões focais com as mesmas características de sinal do líquido cefalorraquidiano em todas as sequências e com diâmetro de 3 a 15 mm.3 Elas foram diferenciadas das SVPVD como descrito acima. Os volumes de matéria cinzenta, WM e líquido cefalorraquidiano foram estimados usando morfometria baseada em voxel; o volume intracraniano (VCI) foi calculado pela soma desses 3 volumes.12

Análise estatística

A carga global do VSPD foi analisada como variável contínua, dada sua distribuição normal, enquanto os subtipos do VSPD (WM e BG) foram estudados como variáveis dicotomizadas (grau 3-4 versus grau 1-2). Como o WMHV tinha distribuição distorcida, utilizamos valores log-transformados naturais (Ln), como em análises anteriores.13,14 A correlação fenotípica entre os marcadores de RM do cSVD foi calculada com base na correlação de Spearman utilizando o software SAS, versão 9.3 (SAS Institute, Inc, Cary, NC).

Para estimar a heritabilidade para o dPVS, WMHV e LI, utilizamos a análise de traços complexos em todo o genoma (GCTA v1.26.0). Isto corresponde a estimar a proporção da variância fenotípica dos marcadores de RM do cSVD explicada por todos os SNPs comuns disponíveis em todo o genoma, usando uma análise de modelo misto linear (Métodos no Suplemento de Dados online-only).15 Em seguida, avaliamos a proporção de hereditariedade compartilhada entre a carga de dPVS e WMHV usando relações genômicas derivadas do SNP e a máxima verosimilhança baseada na relação genômica (método GREML bivariado).16 Usando este método, implementado no software de análise de características complexas em todo o genoma, pudemos estimar a correlação genética entre a carga do dPVS e o WMHV (em geral e por subtipos principais, Métodos no Suplemento de Dados on-line). A estimativa da correlação genética com LI não foi possível (os modelos não convergiram ou produziram valores aberrantes). Todas as análises de hereditariedade e hereditariedade compartilhada foram realizadas em indivíduos não relacionados, após a remoção aleatória de 1 indivíduo de cada par com relação estimada >0,125 (matriz de relação genética >0,125). As análises de carga do dPVS e WMHV foram ajustadas para o ICV, para levar em conta diferenças no tamanho da cabeça, idade, sexo e 20 PCs, como recomendado pelo software.15

Testamos a associação de um escore de risco genético combinando variantes de risco genético independentes conhecidas para WMHV (rs7214628, rs7894407, rs78857879, rs2984613 e rs11679640)14 com a carga do dPVS usando regressão linear (dPVS global) ou regressão logística (dPVS em WM e em BG), ajustando para idade, sexo, os 4 primeiros PCs e ICV. O escore de risco genético foi construído pela soma do número de alelos de risco WMHV em todos os loci de risco WMHV independentes (r2<0,010 entre os SNPs). Este escore não foi ponderado porque o estudo de associação do genoma WMHV a partir do qual os loci de risco foram derivados foi realizado utilizando a meta-análise baseada no escore z, que não produz nenhuma estimativa de efeito.

Resultados

População do estudo

Correlações fenotípicas

Existiu uma correlação fenotípica limitada mas significativa (ρ=0.23; P<0,0001) entre o dPVS no BG e o dPVS no WM – os 2 subtipos principais do dPVS. As correlações fenotípicas entre a SVPVD e outros marcadores de RM do cSVD estão representadas na Tabela 2: todos os marcadores apresentaram algum grau de correlação em P<0,01 (ρ variando entre 0,08 e 0,33). O maior coeficiente de correlação fenotípica (ρ=0,33; P<0,0001) foi observado entre o dPVS no BG e o WMHV total ou pvWMHV. A correlação entre o dPVS (global) e o LI foi menor, em 0,18 (P<0,0001; Tabela 2).

Análise de Hereditabilidade do dPVS e Outros Marcadores de RM do cSVD

A idade, sexo, VCI e 20 hereditariedade ajustada ao PC para o dPVS (global) foi estimada em 59% (P=0.007) e foi maior e significativo no WM, estimado em 79% (P=0,042), em comparação com o BG (Tabela 3). A hereditariedade para a presença da SVP no hipocampo e tronco cerebral foi baixa (<4%) e não significativa. Em uma análise secundária, tomando o quartil superior da contagem da SVP no hipocampo e no tronco cerebral ao invés da presença versus ausência, a hereditariedade para a SVP no hipocampo foi encontrada maior, mas ainda não significativa (Tabela II no Suplemento de Dados online-only). Comparativamente, a idade, sexo, VCI e 20 hereditariedade ajustada ao PC para WMHV foi avaliada em 54% (P=0,010) e significante para pvWMHV e WMHV profundo, enquanto a idade, sexo e 20 hereditariedade ajustada ao PC para LI foi menor e não significante (48%; P=0,278; Tabela 3). É importante ressaltar que as estimativas de hereditariedade do dPVS e outros marcadores de RM do cSVD permaneceram substancialmente inalteradas após o ajuste para hipertensão e diabetes mellitus – os 2 principais fatores de risco conhecidos para cSVD (Tabelas III e IV do Suplemento de Dados on line).

Heritabilidade compartilhada do dPVS com outros marcadores de RM do cSVD

Associação de Variantes de Risco Conhecidas para WMHV Com dPVS Burden

Encontramos uma associação nominalmente significativa de um escore de risco genético combinando todas as variantes de risco de WMHV independentes publicadas com dPVS no BG (P=0.031), sendo que os alelos de risco WMHV em agregado estão associados com o aumento do risco de altos graus de dPVS no BG (Tabela 5). Note-se que esta associação não foi impulsionada por uma única variante de risco para WMHV (P>0,09 para associações individuais SNP-dPVS; Tabela V no Suplemento de Dados on line).

Discussão

Num grande estudo baseado na população de >1500 pessoas idosas não relacionadas com o AVC e sem demência, encontramos estimativas de alta hereditariedade, derivadas de genótipos de todo o genoma, para a carga do dPVS, no mesmo intervalo que as estimativas de hereditariedade para WMHV, enquanto que a hereditariedade do LI foi menor. Algumas das estimativas de hereditariedade para o dPVS e WMHV parecem ser compartilhadas. Encontramos a maior correlação genética entre o dPVS no BG e WMHV, consistente com a alta correlação fenotípica observada entre o WMHV e o dPVS neste local. Também encontramos uma associação nominalmente significativa entre um escore de risco genético combinando variantes de risco genético conhecidas para WMHV e dPVS no BG.

Heritabilidade do dPVS não foi descrita anteriormente ao nosso conhecimento. Para WMHV e LI, nossos resultados são consistentes com as estimativas de estudos baseados na família, mostrando hereditariedade moderada a alta para a carga de WMH (49%-80%)17-21 e hereditabilidade mais baixa para LI (29%).21 De nota, as estimativas de hereditabilidade de estudos baseados na família são sempre maiores do que as estimativas de hereditabilidade derivadas do SNP, pois representam apenas a hereditabilidade de sentido estreito.22

A correlação genética mais forte do WMHV com a carga do dPVS no BG do que no WM fortalece a hipótese de processos pelo menos parcialmente distintos subjacentes ao dPVS nesses 2 locais.9 Nós descrevemos anteriormente que a severidade do dPVS tanto no BG quanto no WM não necessariamente coincide. De fato, entre os indivíduos com grau 4 de DSGP em WM, apenas 23% também tiveram um grau 3 ou 4 no GB, e entre os indivíduos com grau 4 de DSGP no GB, 42% também tiveram um grau 3 ou 4 no WM.3 Nós e outros também temos mostrado que os perfis dos fatores de risco vascular variam de acordo com a localização do DSGP.3,23 Isto é corroborado pelos presentes achados, mostrando uma correlação fenotípica mais forte e uma variação genética compartilhada entre o WMVS e o DSGP no GB em comparação com o DSGP no WM. Curiosamente, apenas a gravidade do DVPVD no GB foi associada a uma maior taxa de declínio cognitivo em pessoas mais velhas da comunidade do Estudo 3C-Dijon9 e com pior desempenho na velocidade de processamento em uma coorte de pacientes com DVPVD ou com alto risco de DVPVD.24 Os níveis de interleucina-6 foram associados com maior gravidade do DVPVD no GB, mas não no WM.25 Assim, parece haver evidências convergentes de que a DSVP pode ter, pelo menos parcialmente, fatores de risco subjacentes distintos, inclusive genéticos, e conseqüências clínicas dependendo de sua localização.

Os mecanismos subjacentes à dilatação da DSVP são especulativos. Uma das hipóteses é uma redução da produção de líquido cefalorraquidiano com o envelhecimento, levando a uma diminuição da depuração linfática e um acúmulo de proteínas tóxicas.26-28 Em paralelo, o endurecimento da parede arterial que ocorre com o envelhecimento ou doença pode levar a uma redução da pulsatilidade arterial, facilitando a dilatação da PVS.28,29 A hipertrofia astrocítica e a perda da polarização da aquaporina-4 perivascular, levando à desregulação do transporte de água astroglial, bem como a disfunção da barreira hemato-encefálica também podem estar envolvidas.30-33 A maioria das vias patofisiológicas hipotéticas para a SVP é derivada de modelos animais. A exploração dos determinantes genéticos da DSGP usando uma abordagem imparcial em todo o genoma pode fornecer uma visão adicional sobre as vias biológicas subjacentes à DSGP em humanos, potencialmente fornecendo evidências adicionais para uma ou mais das hipóteses acima mencionadas ou sugerindo novos mecanismos anteriormente insuspeitos. As altas estimativas de hereditariedade derivadas do SNP para a carga da dPVS sugerem que a busca de determinantes genéticos da dPVS poderia ser de fato uma abordagem eficiente. Embora a correlação genética entre o WMHV e o dPVS tenha sido relativamente alta, uma proporção substancial da contribuição genética para a carga do dPVS parece não ser compartilhada com outros marcadores de RM do cSVD, o que justifica esforços para decifrar especificamente a genética da carga do dPVS. Aumentar o número de participantes e harmonizar as medidas da DSVP em estudos existentes34 , bem como levar em conta a confusão e a modificação dos efeitos por fatores de risco ambiental, especialmente a hipertensão, será importante para esforços futuros.

Forças do nosso estudo incluem um grande tamanho de amostra em um cenário populacional com classificação cuidadosa do dPVS pelo mesmo leitor experiente usando imagens de MR de cérebro inteiro com avaliação precisa da forma do dPVS em imagens T1 milimétricas tridimensionais e diferenciação do WMH e LI usando exame cuidadoso nos 3 planos e exploração das seqüências de densidade T2 e próton. Os esforços para desenvolver uma avaliação automatizada e quantitativa da carga do dPVS estão em curso, mas ainda não estão disponíveis para uso em larga escala. Foram utilizados critérios rigorosos de controle de qualidade com remoção rigorosa de indivíduos relacionados e ajuste para os 20 primeiros PCs. Como os marcadores de RM de doença em pequenos vasos estão fortemente correlacionados com a idade,3,35 não podemos excluir a confusão residual por idade, embora nossa faixa etária na época da RM fosse relativamente limitada e restrita a indivíduos mais velhos (65-80 anos). Futuros estudos em amostras maiores possibilitando análises estratificadas em faixas etárias mais estreitas e também incluindo faixas etárias mais jovens nas quais a carga de cSVD pode ser mais hereditária poderia ser de interesse. É necessário ter cuidado ao interpretar os valores absolutos de hereditariedade e hereditariedade compartilhada, dado o tamanho relativamente limitado da amostra, especialmente para as análises de hereditariedade compartilhada que não atingem significância estatística, devendo, portanto, ser consideradas como exploratórias. A comparação com futuras análises semelhantes em amostras independentes será necessária para obter estimativas mais precisas.

Conclusões

O presente estudo fornece evidências preliminares para uma importante contribuição genética para a carga da DSVP em pessoas mais idosas da comunidade, sugerindo que a busca por fatores de risco genético da DSVP pode ser uma forma eficiente de explorar os mecanismos biológicos subjacentes à DSVP e identificar indivíduos com alto risco de DSVP e suas conseqüências. Outros estudos também são necessários para melhor explorar o significado clínico e a importância da SVP, com possíveis implicações na prevenção tanto da doença cerebrovascular quanto da neurodegenerativa.

Administração de agradecimentos

Abrigamos os participantes do Estudo 3C, por suas importantes contribuições.

Pés