Apoenzyme

5.11.3 Papel das Interacções de Proteína entre Enzimas, Coenzimas e Substratos

Em todos os casos, a coenzima é ligada a apoenzyme sem uma mudança profunda no espectro de absorção. Esta observação sugere que a enzima não distorce o anel de corrina da sua conformação de solução de estado moído. No entanto, não existe informação sobre a identidade do ligante do eixo α no espectro de absorção visível por UV do complexo coenzima-proteína. Estudos demonstraram que o ligante 5,6-dimetilbenzimidazol do α-axial é substituído por uma cadeia lateral de histidina da respectiva proteína em pelo menos três enzimas dependentes da cobalamina: metionina sintase,4,7 metilmalonil-CoA mutase,8,45,46 e glutamato mutase.47 Em contraste, o ligante 5,6-benzimidazol de cobalamina ainda ocupa a posição α-axial do ligante AdoCbl ligado à diol dehidrase48 e à ribonucleotídeo redutase (ver capítulo 5.08).

Para acomodar a coordenação pela cadeia lateral da histidina, o “laço nucleotídico” da base de 5,6-dimetilbenzimidazol, o ribofuranosilfosfodiéster, e a cadeia lateral da propionamida devem balançar para longe do anel do corrin e inserir-se numa bolsa de ligação dentro da proteína. A seqüência de consenso DxHxxG foi identificada em enzimas dependentes de cobalamina que substituem uma cadeia lateral de histidina pelo ligante α-axial.7,49,50 A histidina que coordena ao átomo de cobalto certamente interage com o resíduo de aspartato através de uma ligação de hidrogênio. Além do papel de um ligante coordenador, a função exata do ligante His/Asp como modulador da atividade enzimática ainda não está clara.49 Outros resíduos no local ativo também podem participar de uma rede estendida de ligação de hidrogênio para controlar a reatividade no centro metálico.7

As enzimas dependentes da adenosilcobalamina devem aumentar a taxa de homólise da ligação CoC em pelo menos um fator de 1012 para atingir a taxa observada de catálise.14 Aabilização da adenosilcobalamina exige o enfraquecimento da ligação CoC para permitir a fissão homolítica. Embora não seja um conceito comprovado nas enzimas dependentes da cobalamina, energia suficiente para distorcer (enfraquecer) a ligação CoC poderia facilmente vir da utilização do excesso de energia de ligação que é derivada de múltiplas interações hidrogênio-ligação ao cofator da cobalamina, incluindo as cadeias laterais amida que decoram o anel de corrina.51 As cadeias laterais amida também são importantes elementos de reconhecimento para a ligação às proteínas não enzimáticas de transporte de cobalamina transcobalamina, haptocorrina e fator intrínseco.52 A remoção ou derivatização química de cadeias laterais amida específicas altera a ligação à transcobalamina por 3-40 dobras52 e a remoção completa da cadeia lateral c-amida permite a introdução de uma dupla ligação adicional no esqueleto macrocíclico, achatando assim o anel de corrina com um deslocamento vermelho do máximo de absorção.53

Além de promover a reação desejada, as enzimas dependentes de adenosilcobalamina desempenham uma segunda função importante, evitando as indesejáveis reações laterais que freqüentemente acompanham as reações radicais.54 Esta função de catálise negativa54 exige uma superfície de energia livre altamente limitada, que pode ser vista como um canyon profundo através do qual a reação progride ao longo da superfície de energia livre. Esta canyon tem de ter paredes íngremes, para evitar reacções laterais e restringir as reacções radicais intermediárias altamente reactivas. No final da sequência de reacção, o radical intermédio é extinguido pela recombinação do radical desoxiadenosil e da alamina cob(II), regenerando assim o estado do solo (estado de repouso) do cofactor da adenosilcob(III)alamina. Se a enzima investe 25 kcal mol-1 para promover a homólise da ligação C-Co para iniciar o ciclo catalítico, esta energia deve ser recuperada no final da sequência de reacção. A recuperação da energia não seria possível se uma sequência indesejável de rearranjos ocorresse para produzir um radical termodinamicamente mais estável do que o radical 5′-deoxiadenosil. Portanto, a enzima deve impedir que o radical alquil se rearranje para um intermediário de baixa energia, ou migre através do andaime proteico para formar um radical estável que não possa participar da catálise.55

Uma espécie paramagnética não se forma até que todos os componentes da reação estejam presentes no complexo enzimático-substrato, pois a formação de um radical derivado da coenzima, na ausência de substrato, poderia levar a reações laterais indesejáveis. Experimentos com EPR com metilmalonil-CoA mutase46,55 confirmam que a homólise da ligação CoC ocorre somente após a adição do substrato, como indicado pelo aparecimento de um sinal EPR semelhante ao do produto.46 Da mesma forma, experimentos espectrofotométricos de fluxo parado com a etanolamina amonia lyase mostram que a assinatura de cob(II)alamin aparece no espectro visível somente após a enzima e a coenzima serem combinadas com níveis saturantes do substrato.56-59

Fotolise, termólise e homólise enzimática da ligação CoC da adeno-similcobalamina resulta no par de radicais monoclonais constituídos de cob(II)alamina e do radical 5′-deoxiadenosil.60,61 Como todos esses processos levam à formação do mesmo par de radicais, informações da dinâmica de reação dos estudos de fotólise podem ser relacionadas aos mecanismos de reação enzimática propostos. A foto-homólise da adenosilcobalamina começa com uma promoção eletrônica π → π* no anel de corrina e deve envolver um estado intermediário de carga-transferência no caminho para a homólise de ligação CoC.60,61 Estudos de fotólise de adenosilcobalamina em picossegundo revelam taxas de recombinação de pares de radicais geminados de 109 s-1, com eficiências de recombinação em gaiolas fracionárias, Fc, de cerca de 94%.42,62-64 Estudos de fotólise de nanossegundo e ondas contínuas de cobalamina confirmam taxas de recombinação eficiente de pares de radicais geminados, com um rendimento quântico fotoquímico global de cerca de 20% para adenosilcobalamina e 35% para metilcobalamina.65,66 Na ausência de enzima, uma grande fração dos pares de radicais geminados recombina antes que ocorra uma separação difusa significativa. Para estabilizar o radical desoxiadenosil 5′ e promover a catálise, a enzima deve aumentar a distância de separação dos pares de radicais, provavelmente através de uma mudança conformacional. Qualquer que seja o mecanismo, a alta taxa de recombinação de geminatos no par de radicais exige que uma das funções da enzima seja separar os radicais ou prender temporariamente um dos radicais para evitar recombinações prematuras.

Embora o par de radicais resultantes {5′-deoxiadenosil radical:cob(II)alamin} tenha estados electrónicos idênticos,59-61,67 a homólise enzimática da ligação CoC não pode aceder a um estado electrónico excitado e deve começar com outro processo para enfraquecer a ligação CoC e deslocar o equilíbrio para a dissociação (ver secção 5.11.2). A clivagem induzida pela deformação não só resultará na homólise da ligação CoC, mas este processo também aumentará a distância de separação do par radical se um componente da distorção ocorrer ao longo do eixo apical do cobalto. Esta abordagem de força bruta de estiramento da ligação CoC pode ser o método mais eficiente para alcançar tanto a homólise quanto uma diminuição líquida na taxa de recombinação do par radical.

Também é possível que a enzima fortaleça a ligação CoC e desfavore a homólise através da compressão da interação apical Co-α-N. As propriedades termodinâmicas dos análogos adenosilcobinamídicos + e + foram estudadas.68 Foi observada uma ligação CoC mais forte em + com uma distância de ligação CoN mais curta quando comparada à piridina como a base α-axial. A ligação mais forte de CoC leva a uma mudança significativa em direção à heterólise como o caminho preferencial. Neste sistema modelo, a enzima em estudo, metilmalonil-CoA mutase, deve evitar a heterólise de CoC ou seguir uma via heterolítica.68

Na metionina sintase, a porção corrin de cobalamina é ensanduichada entre dois domínios de um fragmento de 27 kDa, com a cauda do nucleotídeo penetrando em uma bolsa profunda formada por resíduos do domínio C-terminal.7,69,70 Esta sequência contém uma região de hidrofobicidade moderada que é ladeada por segmentos hidrofílicos estendidos.71 As semelhanças estruturais são esperadas entre os domínios que fazem interface com o anel corrin. O domínio α/β que liga a metade inferior do anel de corrin e acomoda a cauda do nucleotídeo estendida (grupo fosfodiester moiety e 5,6-dimetilbenzimidazole) em metionina sintase e metilmalonil-CoA mutase também é esperado em glutamato mutase (vide infra).