Aplicações Emergentes de Esporos Bacterianos em Nanobiotecnologia

Camadas de esporos bacterianos são compostas de proteína, têm conjuntos de subunidades protoméricas encomendados, exibem auto-montagem e têm propriedades protetoras . Como formas de vida metabólicas inactivas adormecidas, os esporos podem sobreviver indefinidamente em estado dessecado, e de facto têm sido documentados como sobrevivendo intactos durante milhões de anos . Os esporos podem resistir a temperaturas tão altas quanto 90°C, bem como à exposição a produtos químicos nocivos . A maioria (mas não todas) as bactérias formadoras de esporos pertencem a dois gêneros principais, Bacillus e Clostridium. Os Clostridia spore-formers, ao contrário do Bacillus, só se diferenciam sob condições anaeróbias, fazendo do Bacillus o gênero mais favorável ao estudo.

As espécies de Bacillus produzem um único esporo ou endosporo (ao contrário dos exosporos fúngicos), dentro da célula bacteriana por um processo de diferenciação que requer a ação coordenada de centenas de genes de desenvolvimento . Os esporos tipicamente maduros são 0,8-1,2 μm de comprimento e têm uma forma esférica ou elipsoidal (ver Figura 1A). O cromossoma bacteriano único é condensado dentro do centro do esporo conhecido como o núcleo. Camadas de membrana lipídica e peptidoglicano modificado envolvem o núcleo do esporo, mas a estrutura mais importante é a camada do esporo. Esta casca proteica laminada proporciona ao esporo uma resistência aos solventes orgânicos e à lisozima. Em Bacillus subtilis até 25 proteínas diferentes estão presentes em duas camadas distintas (Figura 1B), a camada interna e a camada externa, mas em outras espécies há evidências de que a camada é menos complexa e pode, em alguns casos, consistir de apenas alguns tipos de proteína . A estrutura e montagem do revestimento do esporo está agora emergindo como um sistema modelo para entender os processos complexos de montagem morfogenética, semelhante aos estudos clássicos sobre a montagem de fago T4. A camada externa, densa em electrões, da camada de B. subtilis é composta por 5 polipéptidos principais, CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) e CotF (8 kDa). O CotA é uma oxidase multi-cobre e pode acumular-se em formas multiméricas (observadas microscopicamente) dentro das células esporulantes em alguns mutantes com defeito de pelagem. Presumivelmente a oligomerização e a auto-montagem do CotA precede a deposição na superfície do revestimento do esporo. As proteínas CotG e CotB também demonstraram interagir covalentemente e, além disso, CotG e também CotC têm sequências extremamente incomuns de aminoácidos contendo múltiplas repetições (>13) de 12-13 aminoácidos ricos em lisinas e tirosinas. Além disso, muitas das proteínas do revestimento do esporo têm perfis incomuns, ou seja, formas multiméricas e massas moleculares aberrantes, quando examinadas pela SDS-PAGE. Recentemente, foi demonstrado que o revestimento do esporo é realmente flexível e pode se expandir e contrair e esta característica é crítica para a formação de esporos quando o esporo desidrata e similarmente para a germinação quando o esporo rehidrata. Este aspecto de uma estrutura auto-montada é particularmente interessante e pode oferecer uma série de aplicações futuras no fornecimento de medicamentos, nanofabricação e revestimentos de superfície.

Engenharia da camada de esporos bacterianos

Uma estratégia para engendrar esporos Bacillus subtilis para exibir antígenos heterólogos na superfície dos esporos foi recentemente relatada e é ilustrada na Figura 2. Um sistema de exposição esportiva oferece várias vantagens em relação aos sistemas baseados no uso de células bacterianas, entre elas a robustez do esporo bacteriano permitindo o armazenamento na forma desidratada, facilidade de produção, segurança e uma plataforma tecnológica suportada por extensas ferramentas para manipulação genética.

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Exposição da superfície esportiva usando proteínas de revestimento de esporos. O esporo B. subtilis é composto por um núcleo interno (amarelo) cercado por um córtex tipo peptidoglicano (em vermelho) e uma capa proteica subdividida em uma parte interna (verde) e uma parte externa (preta). A proteína de fusão, composta por uma parte portadora (azul) e uma parte passageira (roxa) é exposta na superfície do esporo.

Em contraste com a riqueza de informação disponível sobre como a expressão gênica controla a diferenciação de uma célula em crescimento em um esporo dormente, pouco se sabe sobre os mecanismos de incorporação da proteína na pelagem, a natureza dos componentes estruturais que formam a parte mais externa da pelagem e se existem motivos de ancoragem. As tentativas iniciais de expor proteínas heterólogas na superfície do esporo foram focalizadas em dois componentes da pelagem, CotB e CotC. No caso do CotB esta proteína do esporo é conhecida por ser a superfície localizada enquanto que para o CotC, em relação a outras proteínas da pelagem, esta espécie tem uma alta abundância relativa. A observação de que ambos os componentes da pelagem eram dispensáveis para a formação de um esporo aparentemente normal, bem como para a sua germinação, foi uma característica positiva adicional na escolha do CotB e CotC como potenciais proteínas transportadoras.

Dois antígenos foram inicialmente selecionados como proteínas modelo para exibir na superfície do esporo: i) o fragmento não tóxico do aminoácido C-terminal 459 da toxina do tétano (TTFC), um bem caracterizado e altamente imunogênico 51.8 kDa peptídeo , codificado pelo gene tetC do Clostridium tetani; e ii) o 103 aminoácido B subunidade da toxina do lábio-calor das cepas enterotoxigênicas da Escherichia coli (LTB), um peptídeo de 12 kDa, codificado pelo gene eltB .

CotB como proteína transportadora

Como outros componentes da pelagem, o CotB tem sido associado à camada externa da pelagem com base em evidências genéticas e só recentemente uma análise imunocitofluorimétrica realizada em esporos intactos mostrou que o CotB é acessível a anticorpos específicos do CotB e, portanto, que é muito provavelmente exposto na superfície dos esporos .

O gene estrutural CotB, cotB, está sob o duplo controle transcripcional de σK e da proteína de ligação ao DNA GerE. Como consequência, o cotB é transcrito apenas no compartimento da célula mãe da célula esporulante . Uma vez sintetizado no citoplasma da célula mãe, o CotB é montado em torno do esporo formador de uma forma de alguma forma dependente do CotE, CotG e CotH. Portanto, CotB e a proteína heteróloga eventualmente fundida a ele, não sofre uma etapa de translocação da parede celular, típica dos sistemas de exibição em outras bactérias.

CotB tem uma metade terminal C fortemente hidrofílica formada por três 27 aminoácidos-repetições ricas em resíduos de serina, lisina e glutamina. Os resíduos de serina representam mais de 50% da metade terminal de CotB C. Os resíduos de lisina nos repetidos CotB foram sugeridos para representar locais de reticulação intra ou intermolecular, por analogia com as proteínas do tecido conjuntivo colágeno e elastina. A proteína CotB tem uma massa molecular deduzida de 46 kDa, mas migra sobre SDS-PAGE como um polipéptido de 59 kDa. Recentemente a discrepância entre o peso molecular medido e deduzido foi explicada mostrando que o CotB é inicialmente sintetizado como uma espécie de 46 kDa, e convertido em um homodímero de 59 kDa , que retém ambos os extremos N- an C-terminal previsto a partir da seqüência de nucleotídeos cotB.

A estratégia para obter o recombinante B. subtilis esporos expressando CotB-TTFC ou CotB-LTB em sua superfície foi baseada (i) no uso do gene cotB e seu promotor para a construção de fusões translacionais e (ii) na integração cromossômica das fusões dos genes cotB-tetC e cotB-eltB na seqüência de codificação do gene amyE não essencial (Figura 3A) . A colocação das proteínas de fusão sob sinais transcripcionais e translacionais cotB garantiu o tempo correto de expressão durante a esporulação, enquanto sua integração cromossômica garantiu a estabilidade genética da construção. Devido à falta de informação sobre a montagem do revestimento CotB e sobre os requisitos de ancoragem dos motivos, foram feitas tentativas iniciais posicionando a proteína do passageiro no terminal C, no terminal N ou no meio do CotB (Fig. 3B).

Sistema de visualização da superfície esportiva em B. subtilis . (A) Vista esquemática da integração das fusões genéticas no cromossoma. As barras vermelhas representam a fusão génica, as barras cinzentas e verdes representam respectivamente o gene amyE não essencial de B. subtilis usado como local de integração e o gene da cloranfenicol acetil transferase (cat) usado como marcador de selecção. (B) Representação esquemática das proteínas de fusão utilizando CotB (380 aminoácidos) a todo o comprimento ou CotBΔ105 (275 aminoácidos) ou CotC (66 aminoácidos) como proteínas portadoras (todas em azul). Os três 27-amino-ácidos repetidos de CotB de comprimento total e a parte deles restantes em CotBΔ105 estão em preto. As barras roxas representam a parte heteróloga das fusões (TTFC ou LTB).

Quando TTFC e LTB foram fundidas na extremidade terminal C do CotB, as proteínas quiméricas falharam na montagem correta na superfície dos esporos (Isticato e Ricca, inédito). Tais falhas iniciais foram atribuídas a uma potencial instabilidade das construções, quer ao nível do DNA (sequências repetitivas de DNA), quer ao nível das proteínas. A fim de contornar tais problemas, TTFC e LTB foram fundidos na extremidade terminal C de uma forma CotB eliminada dos três 27 aminoácidos-repetições, CotBΔ105-TTFC (Fig. 3A). Em contraste com a versão de comprimento total, a proteína quimérica CotBΔ105-TTFC foi corretamente montada e exposta na superfície dos esporos . Uma mancha quantitativa de pontos mostrou que cada esporo recombinante expôs uma quantidade de proteína de fusão CotBΔ105-TTFC igual a 0.00022 pg tornando possível concluir que 1,5 × 103 moléculas quiméricas estão presentes na superfície de cada esporo recombinante .

Unlike CotBΔ105-TTFC, CotBΔ105-LTB não foi montada corretamente. A estirpe que expressava esta quimera mostrou redução da esporulação e da eficiência germinativa e seus esporos não eram resistentes à lisozima. Estas observações, juntamente com a análise SDS-PAGE das proteínas liberadas, sugeriram que a presença do CotBΔ105-LTB alterou fortemente a camada de esporos. Uma análise in-silico mostrou alguma homologia entre o produto quimérico (na região de fusão) e LytF, uma endopeptidase associada à parede celular produzida por B. subtilis durante o crescimento vegetativo, levantando assim a possibilidade de que o produto quimérico pudesse interferir na formação adequada da pelagem, degradando alguns componentes da mesma (Mauriello e Ricca, dados não mostrados).

Além da fusão final C-terminal descrita acima, o modelo de proteína passageira TTFC foi fundido também no N-terminal e no meio do CotB (Fig. 3B). Em ambos os casos a forma CotBΔ105 da CotB foi utilizada para evitar os problemas experimentados com a fusão terminal C (ver acima). Tanto a fusão N-terminal como a sanduíche originaram produtos quiméricos que foram devidamente montados na estrutura da pelagem, tanto do ponto de vista qualitativo como quantitativo. Pelo menos no caso do CotB, foi então possível concluir que onde a proteína do passageiro é exposta não afeta a exibição na superfície do esporo.

CotC como proteína transportadora

CotC é um componente de 12 kDa, solúvel em álcali da camada do esporo de B. subtilis, previamente identificado pela genética reversa e depois associado à camada externa da pelagem com base em evidências genéticas . O CotC foi inicialmente considerado como um candidato portador devido à sua relativa abundância na pelagem (Figura 1B). Juntamente com CotG e CotD, CotC representa cerca de 50% do total de proteínas solubilizadas da pelagem. Tais quantidades relativamente altas poderiam permitir a montagem de um número significativo de quimeras baseadas em CotC na pelagem, garantindo assim uma exibição heteróloga eficiente. A expressão do gene CotC está sob o controle do fator σ específico da célula mãe σK e dos reguladores transcripcionais GerE e SpoIIID. Como no caso do CotB, o CotC também é transcrito na célula mãe e a sua montagem na pelagem não requer translocação da membrana. O produto primário do gene cotC é um polipéptido de 66 aminoácidos extremamente rico em tirosina (30,3%) e resíduos de lisina (28,8%). No entanto, foi recentemente demonstrado que o CotC é montado em pelo menos quatro formas distintas de proteínas, variando em tamanho entre 12 e 30 kDa . Duas delas, com massas moleculares de 12 e 21 kDa e correspondendo mais provavelmente a uma forma monomérica e homodimérica de CotC, respectivamente, são montadas no esporo formador logo após a sua síntese, oito horas após o início da esporulação. As outras duas formas, 12,5 e 30 kDa, são provavelmente produtos de modificações pós-tradução das outras duas formas, ocorrendo diretamente na superfície da pelagem durante a maturação dos esporos .

No caso do CotC, apenas fusões terminais C foram construídas até o momento (Figura 3B). Tanto as fusões dos genes CotC-TTFC como CotC-LTB foram obtidas por clonagem tetC ou eltB em moldura com o último códon cotC sob o controle transcricional e translacional da região promotora do cotC. A fusão gênica foi então integrada ao cromossomo B. subtilis no locus amyE por dupla recombinação cruzada (Figura 3A). Estas duas proteínas quiméricas foram montadas sobre a camada de esporos recombinantes sem grande efeito na estrutura e/ou função dos esporos, uma vez que pareciam idênticas aos esporos do tipo selvagem em termos de eficiência de esporulação e propriedades germinativas e de resistência. Western blot, análise citofluorimétrica e, para CotC-TTFC, microscopia de imunofluorescência (Figura 4) mostrou que ambas as quimeras baseadas em CotC foram exibidas na superfície dos esporos recombinantes. Uma determinação quantitativa das proteínas recombinantes expostas nos esporos de B. subtilis revelou que ca. 9,7 × 102 e 2,7 × 103 moléculas de CotC-TTFC e CotC-LTB, respectivamente, foram extraídas de cada esporo.

Embora CotC pareça mais abundante do que CotB dentro da pelagem, quantidades comparáveis de proteínas heterólogas são expostas pelos sistemas baseados em CotC e os baseados em CotBΔ105. Este resultado foi um pouco inesperado, uma vez que CotC parece ser muito mais abundante do que CotB na pelagem. Uma possível explicação vem da recente descoberta de que a extremidade terminal de CotC não só é essencial para a interação com outras moléculas de CotC, mas também com outros componentes da pelagem (Isticato e Ricca, manuscrito em preparação) e, portanto, mostra que o uso de CotC como um portador ainda precisa ser otimizado.

Estabilidade das Proteínas Esportivas

Uma das principais razões para propor o uso do esporo bacteriano como um sistema de exibição favorável é a sua estabilidade bem documentada. Os esporos podem ser simplesmente armazenados à temperatura ambiente durante um longo período de tempo sem redução das suas propriedades de resistência e estabilidade. Esta seria uma propriedade extremamente útil para uma variedade de aplicações biotecnológicas. Como exemplo, se a proteína do passageiro for um antígeno, os esporos recombinantes podem se tornar uma vacina oral com estabilidade térmica ideal para uso em países em desenvolvimento, onde a estabilidade térmica é mais preocupante devido à má distribuição e armazenamento.

No entanto, enquanto a estabilidade dos esporos está bem documentada, a estabilidade das proteínas heterólogas expostas na superfície dos esporos só recentemente foi investigada. Os esporos expressando CotBΔ105-TTFC (ver acima) e os esporos dos pais foram armazenados a -80°C, -20°C, +4°C e à temperatura ambiente e ensaiados em diferentes tempos de armazenamento até 12 semanas. Em todos os casos a quantidade de proteína heteróloga presente na superfície de esporos recombinantes pareceu idêntica entre esporos recém preparados e os armazenados por até 12 semanas (Fig. 5). Estes resultados, indicando que as proteínas heterólogas podem ser expostas de forma estável na superfície de esporos recombinantes, confirmam o sistema baseado em esporos como uma abordagem de exibição muito promissora que poderia superar alguns inconvenientes de outros sistemas e que poderia encontrar aplicações em uma variedade de diversos campos biotecnológicos.

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Análise de pontos manchados de proteínas extraídas de esporos do tipo selvagem e de esporos expondo a quimera CotBΔ 105 -TTTFC. Esporos recentemente purificados expressando a quimera CotBΔ105-TTFC (t0) ou após 4, 8 ou 12 semanas (t4, t8 e t12) de armazenamento à temperatura ambiente foram examinados por ponto blotting de proteínas de esporos extraídas. As concentrações de TTFC purificado (em nanogramas) e de proteínas do revestimento (em microgramas) são indicadas. As proteínas foram carregadas e reagiram com anticorpos monoclonais anti-TTFC (Boeringher), depois com anticorpos secundários conjugados com fosfatos. Sinais de intensidade similar foram obtidos com esporos recém purificados e esporos armazenados à temperatura ambiente por até 12 semanas.

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Prova de Princípio para Vacinação Oral Utilizando o Tétano como Doença Modelo

Sporos expressando CotBΔ105-TTFC têm sido usados para imunizar ratos pela via oral . A IgG sérica e a sIgA fecal mostraram uma clara seroconversão para TTFC. O programa de dosagem utilizou três conjuntos de três doses (1,67 × 1010) durante 5 semanas e foi baseado em regimes optimizados para imunizações orais . Os títulos de IgG específicos de TTFC após 33 dias (>103) sugeriram que estes estavam a níveis de protecção e ratos desafiados com toxina tetânica correspondente a 10 LD50 estavam totalmente protegidos. Dos oito ratos desafiados com uma dose de 20 LD50, sete sobreviveram, sugerindo que este era o limiar de proteção. Um estudo semelhante foi feito usando imunização nasal com esporos CotB-TTFC, mas com uma dose menor e três imunizações. Aqui, as respostas de IgG específicas de TTFC foram mais baixas, mas ainda mostraram seroconversão. Estes estudos mostram que esporos artificiais que expressam um antígeno heterólogo podem ser utilizados para a imunização protectora. Além disso, embora as respostas da mucosa não sejam importantes para a proteção contra o Clostridium tetani (um patógeno sistêmico), elas são obviamente importantes para os patógenos da mucosa. Outros estudos serão necessários para otimizar os regimes de dosagem (menos doses e menos esporos), mas estes estudos seminais abriram o caminho para o desenvolvimento contra patógenos específicos da mucosa. Embora estes estudos sejam encorajadores e demonstrem respostas humorais, ainda não há evidências claras que indiquem respostas celulares. No entanto, foi demonstrado que os esporos se disseminam para o GALT e são encontrados nas Manchas de Peyer (PP) e nos gânglios linfáticos mesentéricos. O pequeno tamanho do esporo (1 μm) permitiria que ele fosse absorvido pelas células M e transportado para o PP, onde poderia interagir com as células que apresentam antígenos. Estudos iniciais mostraram que os esporos podem germinar e persistir por um curto período de tempo dentro dos macrófagos intestinais, assim como extrair Th 1 cytokines in vivo como IFN-γ .