Acessibilidade cromatina e arquitectura

Figure 3: Técnicas de conformação cromossómica. Vários passos de 3C, 4C, 5C, ChIA-PET, e Hi-C.

Captura da conformação cromatina (3C)

3C utiliza a ligação cruzada de formaldeído para bloquear a estrutura tridimensional da cromatina, seguida da digestão enzimática de restrição. Os fragmentos de DNA excisados são então analisados por qPCR e sequenciamento para identificar onde regiões de DNA distantes estão conectadas. Esta abordagem para análise da estrutura e interações da cromatina 3D in vivo foi desenvolvida pela primeira vez em 2002 (Dekker et al, 2002), e desde então tornou-se a base para uma série de técnicas relacionadas que foram desenvolvidas para alcançar maior escala, rendimento ou especificidade.

Circularized cromosome conformation capture (4C)

4C permite a identificação de regiões de DNA previamente desconhecidas que interagem com um locus de interesse, o que torna 4C ideal para descobrir novas interações dentro de uma região específica (Dekker et al, 2006).

4C dicas úteis:

• Escolha as enzimas de restrição certas. Cortadores mais frequentes (ou seja, quatro locais de reconhecimento de bp) são melhores para interacções locais entre a região de interesse e sequências próximas no mesmo cromossoma (van der Werken et al., 2012).
• Optimizar a ligação cruzada. Concentrações mais baixas de formaldeído promovem uma região indesejável de auto-ligações de interesse, mas também previnem “bolas de cabelo” de DNA que impedem o corte de enzimas de restrição. Altas concentrações de formaldeído diminuem os eventos de auto-ligação, mas aumentam as bolas de cabelo. Uma concentração ótima de formaldeído deve ser escolhida para a situação experimental específica a fim de equilibrar estas considerações. O tratamento com formaldeído a 1% durante 10 minutos é um bom ponto de partida para a maioria dos experimentos (van der Werken et al., 2012).

Captura de conformação cromossômica de cópia de carbono (5C)

5C gera uma biblioteca de quaisquer produtos de ligadura de regiões de DNA que se associam com os loci alvo, que são então analisados pela NGS. 5C é ideal quando é necessário um grande detalhe sobre todas as interações em uma determinada região, por exemplo, ao diagramar uma matriz de interação detalhada de um determinado cromossomo. No entanto, 5C não é verdadeiramente genômico, uma vez que cada primer 5C deve ser projetado individualmente, então é mais adequado para uma região específica (Dotsie e Dekker, 2007).

5C dicas úteis:

• Selecione a enzima de restrição correta. Escolher uma enzima que funcione eficientemente sob suas condições experimentais específicas é essencial. Por exemplo, o BamHI não é recomendado para a maioria das experiências devido à ineficiência sob condições 3C (Dotsie et al., 2007).
• Optimizar o design do primer. 5C usa dois primers: um primer 5C avançado que se liga a montante do local de ligação, e um primer invertido que se liga imediatamente a jusante. O comprimento do primer deve ser ajustado para que a temperatura de recozimento seja de aproximadamente 65°C para permitir que os primers recozam exatamente com seus fragmentos de restrição. Certifique-se de que os primers 5C são sintetizados com um fosfato na extremidade de 5′ para a ligadura.
• Use um modelo de controle. Isto irá controlar as diferenças na eficiência do primer. Uma biblioteca de controle construída a partir de toda a região genômica em estudo é recomendada. Se esta biblioteca não for construída, então os pesquisadores devem estar cientes que as freqüências de interação seriam menos precisas.

Análise da interação cromatina por seqüenciamento de tags paired-end (ChIA-PET)

ChIA-PET toma aspectos do ChIP e 3C para analisar a interação de regiões de DNA distantes através de uma determinada proteína.

ChIA-PET é melhor usada para experimentos de descoberta envolvendo uma proteína de interesse e alvos de ligação de DNA desconhecidos. Os locais de ligação do fator de transcrição, por exemplo, são melhor estudados com ChIA-PET, pois esta técnica requer que o DNA seja ligado pelo fator de transcrição in vivo para a interação a ser chamada (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET dicas úteis:

• Sobrepor tags PET para reduzir o fundo. Como a maioria das tecnologias 3C, o ruído de fundo é um desafio técnico. No ChIA-PET particularmente, o ruído pode tornar difícil encontrar interações de longo alcance com o locus de interesse. Uma dica útil para superar isso é exigir que as PETs se sobreponham em ambas as extremidades da região para ser uma interação de longo alcance.

ChIP-loop

ChIP-loop é uma mistura de ChIP e 3C que emprega anticorpos direcionados a proteínas suspeitas de ligar uma região de DNA de interesse. O ChIP-loop é ideal para descobrir se duas regiões de DNA conhecidas interagem através de uma proteína de interesse. O ChIP-loop também é bem adequado para confirmação de interacções suspeitas, mas não para a descoberta de interacções novas (Horike et al., 2005).

ChIP-loop dicas úteis:

• Evitar loops não nativos. O maior problema encontrado com o ChIP-loop é a formação de loops não nativos durante a concentração de DNA antes de ocorrer a ligadura. Uma forma simples de evitar isto é escolher um protocolo que realize a precipitação após a etapa de ligadura (Simons et al., 2007).
• Validar as interacções ChIP-loop. Outro desafio no ChIP-loop pode ser a quantificação precisa dos produtos de ligadura. As tecnologias 3C, especialmente ChIP-loop, captam frequentemente interacções aleatórias. Para combater isso, considere realizar um experimento ChIP em paralelo e usá-lo para validar as interações ChIP-loop. Se uma interacção DNA-proteína-DNA identificada pelo ChIP-loop é de facto real, então ambas as interacções DNA-proteína devem também aparecer nos dados ChIP (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifica os produtos de ligadura de todo o genoma e avalia as suas frequências através de sequenciação de alto rendimento. Hi-C é uma ótima escolha quando é necessária uma ampla cobertura de todo o genoma, e a resolução não é de grande preocupação, mapeando as mudanças na estrutura cromossômica em células tumorais (Lieberman-Aiden et al., 2009), por exemplo.

Hi-C dicas úteis:

• Otimizar a amplificação da biblioteca. A amplificação da biblioteca Hi-C deve gerar produto suficiente para análise, evitando ao mesmo tempo artefactos PCR. Para o fazer, o número do ciclo de PCR deve ser optimizado (no intervalo de 9-15 ciclos). Se não for possível produzir produto suficiente (50 ng de ADN), múltiplas reacções PCR devem ser agrupadas em vez de aumentar o número de ciclos, cinco reacções são normalmente suficientes (Belton et al., 2012).
• Comprimentos de leitura de equilíbrio. Como em qualquer experiência de sequência, leituras de alta qualidade são primordiais. O comprimento de leitura deve ser ótimo para equilibrar a necessidade de leituras longas para mapear as interações, mas não muito tempo para passar através da junção de ligação para o fragmento parceiro. Portanto, 50 leituras bp são ótimas na maioria dos casos (Belton et al., 2012).
• Escolha um tamanho de contentor apropriado. Isto é crítico para a análise de dados. O tamanho da lixeira deve ser inversamente proporcional ao número de interações esperadas em uma região. Use caixas menores para interações intra cromossômicas mais freqüentes e caixas maiores para interações interromossômicas menos freqüentes (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C usa uma combinação de tecnologia de captura de 3C e oligonucleotídeos (OCT), juntamente com seqüenciamento de alto rendimento para estudar centenas de loci de uma só vez. O Capture-C é ideal quando tanto a alta resolução como a escala genómica são necessárias. Por exemplo, analisando o efeito funcional de cada SNP associado à doença no genoma na estrutura cromatina local (Hughes et al., 2014).

Captura-C dicas úteis:

• Escolha cuidadosamente as posições das sondas. É melhor posicionar as sondas perto dos locais das enzimas de restrição, mesmo sobrepondo-se quando possível (Hughes et al., 2014).
• Manter as bibliotecas complexas. A manutenção da complexidade das bibliotecas é a prioridade máxima. Uma biblioteca complexa significa mais interações de alta qualidade na saída. Por este motivo, qualquer coisa que possa diminuir a complexidade da biblioteca deve ser evitada, como uma captura de biotina Hi-C (Hughes et al., 2014).
• Atenção à falsa interação em regiões duplicadas. O processo de mapeamento pode estimular fortes interações entre essas regiões (como pseudogenes) que são na verdade artefatos (Hughes et al., 2014)

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Hughes JR (Agosto 2014). Entrevista por e-mail.

Hughes JR, et al. (2014). Análise de centenas de paisagens cis-regulatórias em alta resolução em uma única experiência de alto rendimento. Nat Genet, 46, 205-212.

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