A engenharia do ribossoma revela a importância da autonomia do 5S rRNA para a montagem de ribossomas

Construção de plasmídeos

Todos os plasmídeos foram construídos pela Gibson assembly50, com os backbones dos plasmídeos preparados por PCR inversa ou digestão de nuclease de restrição e os insertos gerados por PCR ou sintetizados quimicamente pela Integrated DNA Technologies. Os plasmídeos codificadores de rRNA foram inicialmente electroporados em células E. coli POP2136 (os genótipos de todas as estirpes utilizadas neste estudo estão listados na Tabela Complementar 1) e os transformantes foram recuperados em placas de LB suplementadas com os antibióticos apropriados; as placas foram incubadas a 30 °C para prevenir a expressão dos genes rRNA controlados pelo promotor lambda PL31. Todos os outros plasmídeos foram transformados e propagados na cepa E. coli JM109 e cultivados a 37 °C em meio LB suplementado quando necessário com 100 μg/ml de ampicilina (Amp), 50 μg/ml de canamicina (Kan) ou 50 μg/ml de espectinomicina (Spc).

Construção do plasmídeo ptRNA100

O espinha dorsal do plasmídeo incluindo o gene de replicação pA15 e o gene de resistência Spc, foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo ptRNA6751 usando os iniciadores NA1 e NA2 (todos os iniciadores estão listados na Tabela Suplementar 4). O cluster de genes tRNA (codificando tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp e tRNAAsp), sob o controlo do promotor Ptac e do terminador T1, foi sintetizado como um gBlock (Tecnologia Integrada de ADN). O plasmídeo pTRNA100 foi gerado pelo conjunto Gibson. A estrutura do plasmídeo foi verificada pelo digestor de restrição e a presença do cluster tRNA nascido do plasmídeo foi confirmada por amplificação PCR usando iniciadores NA3 e NA4 e por sequenciamento.

Construção dos plasmídeos pDH42, pDH39, e pCH84

As construções portadoras do gene rRNA híbrido 23S-cp5S foram geradas com base no plasmídeo pAM55229, que abriga o ópero rRNA E. coli rrnB. O gene 5S rRNA foi eliminado por PCR inversa usando iniciadores NA17 e NA18, que abrigam o local de restrição Xho1, a digestão do produto PCR por Xho1, e a ligação do DNA. A mutação de resistência ao Ery A2058G foi então introduzida no gene 23S rRNA por mutagênese dirigida ao local usando o kit QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) com primer NA7. O plasmídeo resultante, pAM552Δ5S, foi utilizado para introduzir os genes rRNA do cp5S com ligadores em três locais diferentes dentro do gene rRNA 23S.

Preparação da sequência de rDNA do cp5S para integração no rDNA do 23S foi realizada em uma única reação PCR onde os pares de primers NA8/NA9 (para construções DH39 e DH42) ou NA26 e NA27 (para construções CH84) (100 nM cada) que abrigavam a inserção do rDNA do cp5S, foram combinados com pares de primers (250 nM cada) introduzindo ligadores de sequência aleatória, variando em tamanho de 0 a 3 nt, nas junções ‘esquerda’ e ‘direita’ 23S-cp5S, como se segue: NA10-NA13 e NA14-NA17 para DH39; NA18-NA21 e NA22-NA25 para DH42; NA28-NA31 e NA32-NA35 para CH84.

Para a geração das bibliotecas de plasmídeos DH39, DH42 e CH84, o plasmídeo pAM552Δ5S foi aberto por PCR invertida usando os pares de primers NA36/NA37, NA38/NA39, e NA40/NA41, respectivamente. As inserções de rDNA do cp5S foram introduzidas nas espinhas dorsais plasmidais amplificadas por PCR resultantes pelas reações de montagem da Gibson. Os produtos de reacção foram transformados em células E. coli POP2136 por electroporação e os transformantes foram recuperados em placas de ágar LB/Amp cultivadas a 30 °C (condições que impedem a expressão do rRNA plasmídico). Cada biblioteca tinha pelo menos 3 vezes mais clones do que a diversidade teórica estimada de 7225 variantes. As colónias foram lavadas das placas de LB, as bibliotecas de plasmídeos foram extraídas e armazenadas.

Substituição de ptRNA67 por ptRNA100

O E. coli SQ171 que não tem alelos de rRNA cromossômico e carrega o plasmídeo pCSacB como fonte dos genes rRNAs e o plasmídeo ptRNA67 como fonte dos genes rRNA32,52 cromossômicos ausentes, foi usado como a cepa hospedeira inicial. A fim de substituir o plasmídeo ptRNA67 pelo ptRNA100, células SQ171 foram primeiramente transformadas com ptRNA-Amp (fornecido por Michael O’Connor, University of Missouri, Kansas City), que se assemelha ao ptRNA67 mas confere resistência ao Amp e contém a origem pBR322 da replicação. Os transformadores foram então curados do plasmídeo ptRNA67 através da passagem em meio LB suplementado com Amp e Kan durante ~100 gerações. A perda do plasmídeo ptRNA67 foi verificada através da sensibilidade dos clones ao Spc na replicação do plasmídeo. A deformação resultante foi então transformada com ptRNA100 e plaqueada em ágar LB suplementado com Spc e Kan. Os transformadores foram passados por ~100 gerações em meio LB suplementado com Spc e Kan. A perda do plasmídeo ptRNA-Amp foi verificada pela sensibilidade dos clones individuais ao Amp, como revelado pela replicação em placas. A presença de ptRNA100 e a ausência de ptRNA67 foram adicionalmente verificadas por PCR e digestão de restrição dos plasmídeos totais preparados a partir do clone resultante.

Inactivação do gene recA nas células SQ171/ptRNA100

O gene recA na estirpe SQ171/ptRNA100 foi inactivado por transdução de fago P1. A estirpe doadora BW25113 recA::cat foi primeiramente preparada pelo procedimento convencional de recombinação52 usando o cassete de resistência ao cloranfenicol (Chl)- do plasmídeo pKD352. O cassete foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores NA42 e NA43. O fragmento PCR foi transformado na estirpe BW25113 carregando o plasmídeo vermelho recombina-expressor pDK46. Após verificação da integração do cassete do gato e cura do pKD46, as células BW25113 recA::cat foram usadas como doadoras para a transdução do fago. A transdução de fagos P1 foi realizada de acordo com o protocolo padrão53, exceto que a incubação de recuperação foi estendida de 1 a 3 h antes do revestimento dos transdutores nas placas LB/agar complementadas com Kan, Spc e 15 μg/ml Chl. Para a excisão do cassete do gato, a cepa resultante foi transformada com plasmídeo pZFLP-TetR que codifica a enzima flippase e os transformantes foram revestidos na placa LB/agar suplementada com Kan, Spc e 2,5 μg/ml de tetraciclina (Tet). A eliminação do gene do gato foi confirmada por PCR e pela sensibilidade Chl dos clones. Em seguida, o plasmídeo pZFLP-TetR foi curado através da passagem das células durante ~100 gerações em meio LB suplementado com Kan, Spc, e os clones resultantes foram testados quanto à sensibilidade ao Tet. A estirpe resultante foi denominada SQA18 (Tabela Suplementar 1).

Introdução das bibliotecas 23S-cp5S em células SQA18

As bibliotecas plasmídicas extraídas das células POP2136 foram transformadas em células SQA18 por eletroporação. Após 2 h de recuperação a 37 °C, os transformadores foram incubados em placas de ágar LB/Amp que foram então incubadas durante a noite a 37 °C. As colônias foram lavadas das placas de ágar e 0,01 A600 (~106 células) foram colocadas em um volume de 2 ml de meio LB suplementado com 150 μg/mL de Ery e 0,25% de sacarose. Após o crescimento durante 16 h, as células foram colocadas em placas de ágar contendo Amp, 1 mg/ml de Ery e 5% de sacarose. As placas foram incubadas durante 48 h a 37 °C. Colónias viáveis apareceram com as bibliotecas de DH42 e CH84, mas não com a biblioteca de DH39. Várias das colónias que apareceram nas placas foram testadas por PCR de colónia para a presença de 23S-cp5S rDNA utilizando os pares de iniciadores NA44/NA45 para a construção de DH42 e os iniciadores NA46/NA47 para a construção de CH84. A ausência do gene wt 5S rRNA foi verificada por PCR de colônia usando os primers NA48 e NA49.

Seleção dos ligadores rRNA preferenciais 23S-cp5S

A biblioteca total de plasmídeos DH42 isolados das células POP2136 foi transformada em células SQA18 e plaqueada em placas LB/Amp, como descrito acima. As colônias (~50.000) foram lavadas da placa e o plasmídeo total foi extraído de ~109 células e utilizado como biblioteca de pré-seleção.

Aproximadamente 109 células foram então submetidas ao procedimento de troca de plasmídeo. Especificamente, elas foram colocadas em um volume de 20 ml de meio LB suplementado com 150 μg/mL de Ery e 0,25% de sacarose. Após o crescimento durante 4 h, as células foram plaqueadas em placas de ágar contendo Amp, 1 mg/ml de Ery e 5% de sacarose. As placas foram incubadas durante 48 h a 37 °C. As colônias (~50.000) foram lavadas da placa. O plasmídeo total extraído destas células representou a biblioteca pós-selecção.

O rDNA cp5S ladeado por 23S sequências de rDNA e ligadores foi amplificado por PCR a partir das preparações plasmídicas da biblioteca pré e pós-selecção, utilizando os iniciadores NA50 e NA51. As bibliotecas de PCR foram submetidas à sequenciação de próxima geração.

O factor de enriquecimento dobrável para cada combinação de ligadores foi calculado usando o seguinte procedimento. Após cortar o adaptador, toda a sequência de rRNA do cp5S, excepto os 4 nucleótidos terminais em cada extremidade, foi eliminada para reduzir o número de variantes de sequência falsas que surgiram devido a erros de sequenciação dentro da sequência de codificação 5S. Os motivos da seqüência resultante foram contados nas bibliotecas de pré e pós-seleção e a freqüência da fração de cada variante de linker foi calculada.

Preparação do RNA celular total

Culturas noturnas das cepas E. coli POP2136 ou SQA18 foram cultivadas a 30 °C ou 37 °C, respectivamente, em meio LB/Amp. As culturas foram diluídas 1:100 em 2 ml de meio fresco e cultivadas a 37 °C até A600 ~ 0,5. As células foram colhidas por centrifugação (5000 × g, 1 min) e ressuspendidas em 100 μl de tampão de lise. Após adição subsequente de 400 μl de tampão de extracção (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) e incubação durante 5 min à temperatura ambiente, o RNA total foi extraído por extracção de fenol/clorofórmio. O RNA foi precipitado com etanol, o sedimento de RNA foi lavado com 1 ml de etanol a 70%, dissolvido em água livre de RNase-sem RNA, congelado de imediato e armazenado a -80 °C.

Análise do gradiente de sacarose dos ribossomos e polissomas

Culturas de E. coli de noite foram diluídas em 50 ml de meio LB/Amp e cultivadas a A600 ~ 0,5. Chl foi adicionado a uma concentração final de 125 μg/ml e após 5 min de incubação, as células foram colhidas por centrifugação (5000 × g, 10 min, 4 °C). As células foram ressuspendidas em tampão de lise gelada (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, lisozima 1 mg/ml, deoxicolato de sódio 0,25% e 2U de RQ1 DNase I sem RNase). As células foram lisadas por três ciclos de congelamento-descongelamento. Os lisados foram clarificados por centrifugação (20.000 × g, 15 min, 4 °C) e 20 A260 unidades de lisado foram carregadas em 12 mL de 10-40% de gradiente linear de sacarose em tampão 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoetanol. Os gradientes foram centrifugados (3 h, 4 °C) a 39.000 rpm em um rotor SW41 (Beckman). Os gradientes foram fracionados usando um fracionador (BioComp), registrando a absorvância a 254 nm. As frações correspondentes às subunidades 50S, 70S ribossomos e polissomos foram agrupadas. O RNA foi isolado por extração de fenol/clorofórmio e precipitação de etanol.

Isolamento de ribossomos 70S e subunidades de ribossomos

Para o isolamento de ribossomos de pares estanques54, as culturas de E. coli durante a noite foram diluídas em 1 L de meio LB/Amp e cultivadas em A600 ~ 0,5. As células foram colhidas por centrifugação (5.000 g, 15 min, 4 °C), ressuspenso em tampão A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-mercaptoetanol, 10 U/ml de DNase I sem RQ1), e lisado utilizando prensa francesa a 10.000 psi. Os lisados foram clarificados por centrifugação em rotor JA25-50 (Beckman) a 13.000 rpm durante 30 min a 4 °C e os sobrenadantes foram carregados em 10 ml de almofada de sacarose 1,1 M preparada em um tampão contendo 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 e 6 mM β-mercaptoetanol, em tubos de centrifugação Quick-Seal de 35 ml (Beckman). Os Ribossomos foram granulados por centrifugação durante 16 h a 36.000 rpm (4 °C) em um rotor Ti70 (Beckman). Os ribossomos foram ressuspensos em tampão B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl e 6 mM β-mercaptoetanol) e 100 A260 unidades foram carregadas em 10-40% de gradiente de sacarose preparado em tampão B nos tubos de um rotor SW27 (Beckman). Os gradientes foram centrifugados durante 21 h a 20.000 rpm (4 °C) em um rotor SW27, fracionados usando fracionador de gradiente (BioComp) e frações contendo ribossomos 70S e subunidades de ribossomos 50S foram agrupadas separadamente. O material foi concentrado utilizando concentradores de 2 ml de Vivaspin (Sartorius) com membrana de triacetato de celulose e recuperado em tampão de armazenamento de ribossomos (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanol). Alíquotas de ribossomos e subunidades ribossômicas foram congeladas e armazenadas a -80 °C. Quando necessário, o rRNA foi isolado por extração de fenol/clorofórmio e precipitação de etanol.

Para isolamento das subunidades 50S dos ribossomos 70S, 130 ribossomos pmol, preparados conforme descrito acima, mas concentrados por pelotização e armazenados no tampão de armazenamento dos ribossomos (20 mM Tris-HCl, pH 7.0,10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanol) foram diluídos no tampão D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-mercaptoetanol) para alcançar uma concentração final de MgCl2 de 1,5 mM. As subunidades Ribosomal foram separadas por centrifugação em 10-40% de gradientes de sacarose preparadas em tampão D que continham 1,5 mM MgCl2. Os gradientes foram centrifugados durante 16 h a 27.000 rpm (4 °C) em um rotor SW27 (Beckman), fracionado, concentrado e recuperado no tampão de armazenamento do ribossomo, conforme descrito acima. As alíquotas foram congeladas e armazenadas a -80 °C.

LC-MS/MS análise de proteínas ribossômicas

Composição protéica dos ribossomos 70S e das subunidades ribossômicas 50S, preparadas conforme descrito acima, foi determinada usando espectrometria de massa quantitativa55. As preparações de ribossomos foram misturadas numa razão molar 1:1 com ribossomos wt marcados com SILAC contendo arginina marcada com massa (Arg6: 6HN4O2 e lisina (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Alemanha). As proteínas ribossômicas foram digeridas com tripsina (Sigma) ou Lys-C protease (Wako, EUA). Os peptídeos resultantes foram fracionados e analisados via LC-MS/MS usando LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). As análises de identificação e quantificação de proteínas foram realizadas utilizando Maxquant v1.5.6.056 e Perseus v1.6.2.357. A pesquisa do Maxquant foi feita utilizando o banco de dados de seqüência proteica E. coli MG1655 da UniProtKB (24.04.2019). A abundância de proteínas foi normalizada para proteínas de subunidades grandes e pequenas separadamente por meio do deslocamento da relação L/M média para 1,

Sondagem química da estrutura do rRNA

estrutura do rRNA foi sondada nos ribossomos 70S isolados de células wt ou mutantes. Os ribossomos (22 horas) foram colocados em 50 μl de tampão de modificação e activados por incubação durante 5 min a 42 °C. A reação de modificação foi iniciada pela adição de 2 μl de sulfato de dimetila (Sigma) diluído 1:10 em etanol. As amostras foram incubadas durante 10 min a 37 °C. As reações de modificação foram interrompidas pela adição de 50 μl de solução de parada recentemente preparada (600 mM NaOAc, 1 M β-mercaptoetanol) e 300 μl de etanol. As amostras foram precipitadas, ressuspendidas em tampão (300 mM de acetato de sódio, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5% SDS) e o RNA foi isolado por extração de fenol/clorofórmio e precipitação de etanol. As extensões dos primers foram realizadas utilizando primers NA56-NA57.

Análise do conteúdo de rRNA mutante

Para a análise da presença do rRNA modificado 23S-cp5S, o RNA total foi isolado das frações de gradiente de sacarose, conforme descrito acima. O conteúdo de rRNA mutante 23S-cp5S foi avaliado por extensão do primer, utilizando os primers NA58 ou NA59. Especificamente, o iniciador marcado com 5′ (0,5 pmol) foi recozido para 1 μg de RNA total em tampão de hibridação (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl), incubando a 90 °C durante 1 min e depois resfriando durante 15 min a 42 °C, e estendido com 2 U de transcriptase reversa de AMV (Roche) durante 20 min a 42 °C num volume de reacção final de 8 µl. Para o iniciador NA58, a reacção continha 0,25 mM de ddATP e 0,2 mM de dCTP, dGTP, dTTP. Para o iniciador NA59, a reacção continha 0,25 mM de ddCTP e 0,2 mM de dATP, dGTP, dTTP. As reacções foram terminadas com a adição de 120 μl de tampão de paragem (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70% EtOH), arrefecimento a -80 °C durante 15 min, e pelotização dos ácidos nucleicos por centrifugação a 15.000 × g durante 1 h a 4 °C. Os sobrenadantes foram removidos, os pellets foram secos e dissolvidos em corante de carga de formol. Os produtos cDNA foram resolvidos em um gel de poliacrilamida desnaturalizante a 12% e visualizados pela fosforimagem.

Tradução in vitro

Reações de tradução in vitro foram realizadas no sistema de tradução livre de células PURExpress (New England Biolabs) Δribosome. Os modelos de DNA contendo o promotor de RNA polimerase T7, o local de ligação do ribossomo e a sequência de codificação de proteínas foram preparados por PCR. O modelo ermBL foi preparado utilizando os primers NA52-NA55. O modelo GFP foi gerado a partir do gene sf-gfp do plasmídeo pY71-sfGFP58 usando os iniciadores NA31 e NA32. Dihydrofolate reductase (DHFR) foi expresso a partir do modelo de plasmídeo fornecido com o kit PURExpress.

Reação de translação para expressão de GFP foi montado em um volume total de 10 μl e continha 2 μl da solução A, 1 do kit PURExpress.2 μl da mistura de fator, 1 μl da mistura de aminoácidos (3 mM cada), 1 μl do tRNA (20 μg/ml), 16 U do inibidor RiboLock RNase (ThermoFisher), 10 ng de modelo GFP e 12 pmol de ribossomos wt ou mutantes. As amostras foram colocadas em poços de 384 poços de parede preta/placa de cultura de tecidos de fundo plano claro (BD Biosciences) e cobertas com a tampa. As reacções foram incubadas a 37 °C num leitor de microplaca (Tecan) com fluorescência GFP a cada 10 min em λexc = 488 nm e λem = 520 nm durante um período de 4 h.

Expressão de DHFR foi seguida pela incorporação de -L-methionine na proteína de tamanho normal. A tradução foi realizada em 10 μl reações montadas como descrito acima, mas complementadas com 5 μCi -L-metionina (1175 Ci/mmol), usando 50 ng do modelo de DNA e 6 pmol de ribossomos wt ou mutantes. As reações foram incubadas a 37 °C. A cada 12 min, 1 μl alíquotas foram retiradas, misturadas com 3 μl de gel contendo SDS e armazenadas em gelo até a conclusão da pista de reação. Os produtos protéicos foram analisados por eletroforese SDS-gel em 16,5% Bis-Tris gels (Biorad) usando NuPAGE MES/SDS running buffer (Invitrogen). Os géis foram corados, secos e expostos a uma tela fosforimager durante a noite. Faixas radioativas foram visualizadas por fosforimagem.

Análise crio-EM dos ribossomos 70S e subunidades 50S

Redes crio-EM foram preparadas como se segue. Grades de cobre de 400 M revestidas com carbono rançoso e uma camada fina de carbono de 2 nm (Ted Pella Inc.) foram descarregadas com corrente de 20 mA com polaridade negativa para 60S em uma unidade de descarga PELCO easiGlow glow. Um Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) foi pré-equilibrado para 4 °C e 95% de umidade relativa. Uma alíquota de ribossomos previamente congelados com flash foi descongelada e, quando a opalescência foi notada, a solução foi limpa em uma microcentrífuga (10 minutos a 16.000 × g a 4 °C). A concentração do sobrenadante purificado foi derivada de A260 medido usando um Nanodrop (ThermoFisher) e os ribossomos foram diluídos a 200 nM em tampão LPP. Três µl de solução de 200 nM de ribossomos foram aplicados na grelha; após um atraso de 10S a grelha foi blotted para 4S e depois mergulhada em etano líquido refrigerado a nitrogénio líquido.

Os dados foram recolhidos num microscópio electrónico Talos (ThermoFisher) operando a 200 KV e equipado com um detector de electrões directo K3 (Gatan Inc.) tendo como alvo 0,5-1,8 μm subfocus. A coleta de dados foi automatizada com SerialEM59 usando a inclinação do feixe para coletar vários filmes (por exemplo, um tiro no centro, 6 com deslocamento) em cada posição de estágio60. Os filmes de super-resolução tinham um total de 19 frames com 1,5 e-/Å2 por frame para uma dose total de 30 e-/Å2 na amostra. Um total de 5222 filmes foram coletados durante 22 h. Os filmes foram alinhados durante a coleta de dados usando IMOD61 para descompactar os quadros, aplicar a referência de ganho, armazenar os dados da super-resolução em pixels físicos de 0,87 Å na amostra e corrigir o desvio da imagem.

Passos iniciais da geração do mapa 3D a partir da determinação de CTF, coleta de partículas livres de referência (489.732 partículas) e criação da pilha foram realizados no cisTEM. O alinhamento e refinamento de partículas foram realizados no Frealign 9.11 e no cisTEM62,63. Para acelerar o processamento, foram preparadas pilhas de imagens 2×-, 4×- e 8×-binned usando resample.exe, que faz parte da distribuição FREALIGN64. O modelo inicial para alinhamento de partículas dos mapas 70S foi o EMD-100365, que foi reduzido para combinar com a pilha de imagens 8× encapsuladas usando o EMAN266. Duas rodadas de busca no modo 3 com um corte de alta resolução de 30 Å e depois 20 Å foram executadas usando a pilha de imagens 8× binned. Em seguida, 7 rodadas de refinamento do modo 1 foram executadas com a pilha 4×, eventualmente não compactada, uma vez que as conchas de resolução foram gradualmente adicionadas (limite de 5 Å) e a resolução atingiu 2,94 Å. O refinamento de deslocamento de feixe foi usado para melhorar a resolução geral para 2,87 Å.

Vinte rodadas de classificação de probabilidade máxima 3D sem mascaramento e com resolução de 14 Å foi usado para separar rapidamente partículas 8x em 12 classes de diferentes composições revelando subunidades de 50S, ribossomos 70S sem tRNA, ou ribossomos 70S com tRNAs e os 30S em uma conformação rotativa ou não rotativa (Suplemento Fig. 3a). Partículas 50S (133.490), partículas 70S vazias (120.428), ou partículas 70S em estado não-rotacionado e sem tRNA (55.677) foram criadas usando a pilha 1x binned usando merge_classes.exe, parte do pacote Frealign, exigindo pontuação de partículas de 0 e ocupação mínima de 50%. Os subtacks foram então novamente colocados em 4x usando resample.exe para acelerar os passos de classificação.

O subtack de partículas 50S foi separado em 6 classes com uma máscara de foco com raio de 55-Å ao redor da porção 5S rRNA do rRNA híbrido 23S-cp5S. As classes com uL16 e/ou bL33 fracos ou ausentes e classes que diferem na posição rRNA 5S foram separadas. As classes foram reconstruídas com alinhamento original e parâmetros de inclinação do feixe em 1x de fiação e uma dessas classes foi utilizada para modelagem estrutural conforme detalhado na seção seguinte.

As partículas 70S também foram investigadas. O subcontack de partículas 70S vazio (sem tRNA) foi separado em 12 classes usando a mesma máscara de foco 55-Å. As classes exibiram diferenças na ocupação uL16 e/ou bL33 e posição 5S rRNA, semelhantes às classes 50S descritas acima. Entretanto, em contraste com as partículas 50S, 3 das 12 classes 70S vazias revelaram um PTC normalmente dobrado.

Classificação do subtack de partículas 70S clássico de estado tRNA ligado a 12 classes com a mesma máscara revelou uma ocupação quase estequiométrica de 16 uL, e todas as partículas tinham um PTC normalmente dobrado e uma forte densidade de P-tRNA. Em contraste, a ocupação de tRNA do local A era fraca em algumas classes com densidade L33 mais fraca. A classificação das partículas 70S com uma rotação de 30S e P/E-tRNA de estado híbrido em 12 classes também revelou ocupações variáveis de uL16 e bL33, e sete classes apresentavam PTC aberrante.

A estrutura 3.2-Å cryo-EM do ribossomo 70S ligado com o A e P tRNAs67 foi usada como modelo inicial para refinamentos de estrutura. Os componentes/domínios do ribossoma foram encaixados em mapas usando a Quimera68. Aqui, o talo 50S, L1, L11, 30S corpo e cabeça, e os tRNAs foram encaixados independentemente. A modelagem do rRNA 5S, e ajustes no PTC e centro de decodificação foram feitos usando o PyMOL69. Os modelos estruturais foram refinados usando simulação de recozimento em espaço real usando RS Ref 70,71 contra os mapas correspondentes. Os parâmetros de refinamento, como o peso relativo das restrições estereoquímicas e o termo de energia experimental, foram otimizados para produzir a estereoquímica ótima da estrutura, o coeficiente de correlação de espaço real e o fator R, que relata o ajuste do modelo ao mapa72. Restrições estruturais secundárias, compreendendo restrições de ligação de hidrogênio para proteínas ribossômicas e restrições de para-base para moléculas de RNA, foram empregadas conforme descrito73. As estruturas foram refinadas em seguida utilizando fenix.real_space_refine74 seguido por uma rodada de refinamento em RSRef aplicando restrições harmônicas para preservar a geometria das proteínas70,71. O Phenix foi utilizado para refinar os fatores B dos modelos contra seus respectivos mapas sem filtragem do fator B74. Os modelos estruturais resultantes possuem bons parâmetros estereoquímicos, caracterizados por baixo desvio dos comprimentos e ângulos ideais de ligação e concordam estreitamente com os mapas correspondentes, conforme indicado pelos coeficientes de correlação elevados e baixos fatores R de espaço real (Tabela Complementar 2). As figuras foram preparadas em PyMOL69.

Resumo do relatório

Outras informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.